具有抗肿瘤活性放线菌代谢产物的筛选及其作用机制研究

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癌症是一种发病率和死亡率均很高且呈上升趋势的疾病。由于其发病机制的复杂性,至今尚无完全治愈它的有效药物。微生物代谢产物是抗癌药物的丰富资源,目前全球使用的抗癌药物中,有50%是直接或间接来自微生物。土壤微生物种类齐全,数量多,从其代谢产物中发现各种活性物质的潜力巨大,是主要的微生物资源。本实验采用MTT体外筛选法从350株土壤放线菌中初筛得到16株能明显抑制A549和HGC细胞生长的放线菌,又通过碘化丙啶(PI)荧光染色流式细胞仪技术复筛,结果显示:菌株1070抗肿瘤活性组分能致使32.07%的A549细胞出现亚二倍体峰。应用萃取、沉淀、大孔树脂初步分离活性产物,透析法测得该抗肿瘤活性成份的分子量大于10000道尔顿,全波长扫描、茚三酮显色和酸水解后纸层析结果表明:菌株1070抗肿瘤活性组分为多糖类物质,而非蛋白质类和核酸类物质。MTT法检测菌株1070活性成分在各种浓度、不同时间对A549细胞的影响,测得其抗肿瘤活性物质对A549细胞的IC50值为211μg/mL(72h);腹腔注射方式测定该活性物质的对小鼠的LD50为5988mg/kg(2天)。扫描电镜观察到受药细胞的细胞膜连接复合物消失,细胞变圆;透射电镜观察到受药细胞胞浆内出现大量类似自噬体的小泡,且细胞核无明显改变,细胞膜完整,无内溶物外漏。罗丹明123荧光染色流式结果表明菌株1070活性物质能使A549细胞线粒体受到损伤,线粒体膜电位下降至43.72%,MDC(单丹磺酰尸胺)荧光染色流式仪检测出菌株1070活性物质能使A549细胞产生自噬体,比率为29.74%,荧光显微镜观察AO活细胞染色发现A549细胞胞浆内出现自噬体,Western-blot分别检测了LC3和Beclin-1蛋白表达情况,发现菌株1070活性物质不但可使LC3-Ⅰ型蛋白像LC3-Ⅱ型蛋白转化,而且使Beclin-1蛋白表达量显著增加。从上述实验结果初步判断,菌株1070活性物质是通过诱导A549细胞发生自噬来抑制肿瘤细胞增殖的。通过对菌落、菌丝体形态的考察、生理生化特性的考察以及16S rDNA保守序列测定,初步判断菌株1070为Streptomyces capillispiralis。
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