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硒是人体不可或缺的微量元素,是人体多种含硒蛋白的重要组成成分。无机硒对人体毒性较大且难以吸收,以灵芝（Ganoderma lucidum）作为富硒的中间载体,通过生物转化可以将无机硒转变为对人体有益,毒性较小的有机硒。硒蛋白是真菌有机硒的主要存在形式,除了作为硒的补充剂,硒蛋白以及含硒肽分子还具有抗肿瘤、免疫调节等特殊的生理功能。在食品产业中如何有效利用富硒蛋白资源受到研究者的重视。大型真菌的蛋白提取工艺多数以超声辅助碱法为主,超声辅助碱法具有提取效率高、工艺操作简便等优点,但超声时间过长或碱液浓度过高会对蛋白结构产生破坏,最终蛋白提取得率难以提升。酶法提取工艺反应条件温和,但存在成本过高等缺点。因此开发高效率的硒蛋白提取工艺,对硒蛋白的开发利用及深加工具有重要的现实意义。本文通过筛选及诱变育种获得了一株高耐硒灵芝。以获得硒蛋白为目标,将异源表达获得的β-1,3-葡聚糖酶和果胶酶对灵芝细胞进行水解,通过酶水解辅助短时超声破壁及碱裂解的方法,提高了灵芝硒蛋白提取得率。主要研究内容如下:（1）从我国高硒自然环境中筛选获得一株耐硒灵芝的菌丝体ST308,通过60Co-γ射线诱变育种获得高耐硒灵芝突变菌株ML2613。发酵结果显示,ST308和ML2613在发酵培养基中生长速度大致相同。在高硒液体发酵培养基中出发菌ST308的生长受到明显的抑制,而ML2613的生长速度显著高于出发菌,在第5天ML2613菌体干重为17.3g·L-1。（2）ML2613在15 L发酵罐中Na2Se O3·5H2O添加浓度为180 mg·L-1。发酵72 h时,菌体干重为16.4 g·L-1,富硒灵芝菌丝体硒含量为821.4 mg·L-1。使用超声辅助碱法提取灵芝粗蛋白,蛋白提取得率为37.2%,蛋白等电点p H为3.0。用饱和硫酸铵进一步纯化,冻干得到灵芝蛋白,蛋白总硒含量为623.0 mg·kg-1。通过HPLC-ICP-MS联用分析技术分析灵芝硒蛋白中硒代氨基酸形态,对三种硒代氨基酸进行定量分析。硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸含量分别为452.7 mg·kg-1、6.5 mg·kg-1和147.2mg·kg-1,进一步推算出硒蛋白中硒代氨基酸的硒含量为276.2 mg·kg-1,占硒蛋白总硒的44.3%。（3）异源表达了来源于纤维微菌CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶基因。以E.coli BL21（DE3）为宿主菌构建重组菌BL21/6906,表达β-1,3-葡聚糖酶,获得重组酶BGL6906。以茯苓多糖为底物时,重组酶BGL6906纯酶比酶活为567.8 U·mg-1,最适p H为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h时,胞外酶活达到67.0 U·m L-1。用BGL6906和市售果胶酶交替水解灵芝菌丝体,菌丝体形态发生明显变化,并有少量原生质体的出现。以此建立了灵芝细胞裂解工艺:对两次酶解两次过滤后的菌丝体使用超声辅助碱法提取灵芝蛋白,在超声5 min时蛋白提取得率达到76%。（4）市售果胶酶中的蛋白酶对BGL6906具有很强的降解作用,因此需要获得低蛋白酶活性的果胶酶,为此研究了果胶酶在巴斯德毕赤酵母不同宿主中的表达及其与BGL6906联合水解灵芝菌丝体的方法。以毕赤酵母GS115为宿主菌,构建重组菌GS115/pg605、GS115/pmj5a,分别表达聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶,重组酶酶活分别为:114.0 U·m L-1和5.6 U·m L-1。将GS115/pg605和GS115/pmj5a进行摇瓶发酵并浓缩,将浓缩后的酶液以酶活5:1的比例制成混合酶液,命名为果胶酶PGMJ5A。以蛋白酶缺陷的毕赤酵母SMD1168为宿主菌分别构建重组菌SMD1168/pg605和SMD1168/pmj5a。SMD1168/pg605在15 L发酵罐中发酵156 h时酶活达到最高,为194.5 U·m L-1;SMD1168pmj5a在156 h时酶活达到最高,为16.2 U·m L-1。收集发酵液浓缩,浓缩后的酶液以酶活5:1的比例制成混合酶液,命名为果胶酶SPGMJ5A。使用BGL6906和PGMJ5A协同水解灵芝菌丝体,菌丝体形态未发生明显改变。研究发现GS115表达的PGMJ5A仍然具有较高的蛋白酶活性,导致BGL6906被降解而无法水解灵芝细胞壁。用BGL6906和SPGMJ5A对灵芝菌丝体细胞壁进行酶解,虽然未出现大量的原生质体,但菌丝体形态出现明显改变,其细胞壁强度呈现一定的弱化现象。后续使用超声辅助碱法提取灵芝蛋白,在超声10 min时蛋白提取得率达54%,而对照组在相同的时间内蛋白提取率只有27%。