转基因技术问世以来发展迅速,广泛应用于农业生产。该技术能够提高农作物产量,改良农产品品质,提升农作物对逆境的抵抗能力,但是,由于外源基因随着花粉的扩散,由此也带来很多生物安全问题。这些生物安全性问题已经引起了公众的广泛关注和担忧,为了解决相关问题,越来越多的生物技术被采用,其中,位点特异性重组酶系统研究得比较广泛。Cre/loxP重组酶系统以其简捷高效,因而广泛应用于动植物中删除转基因作物的外源基因。但是,该系统也存在明显的缺陷,即不能应用于杂交作物。根据前人研究报道,将完整的结构蛋白拆分为互补的两个部分,当拆分片段共表达时,能够实现蛋白结构的重建和恢复结构蛋白的活性。根据前期研究结果,本论文将采用Cre蛋白核苷酸序列第866 bp为拆分位点,采用Intein介导的蛋白拆分技术将Cre重组酶拆分为互补的N端和C端。分别构建两个植物表达载体,之后转化野生型拟南芥进行人工杂交。如果采用花原基特异性启动子控制拆分后重组酶片段的表达,则杂交后,在营养生长阶段外源功能基因仍可保留,到生殖生长阶段重组酶将删除外源基因,使种子和果实不含有外源基因,以期实现由转基因作物生产非转基因产品。此系统为基因删除系统在大田中的推广应用奠定了基础,并最终消除公众对转基因作物生物安全隐患的担忧。主要结果如下:一、内含肽对重组酶Cre拆分后删除活性恢复的影响将Cre蛋白从核苷酸序列第866bp处拆分为N端和C端,以pCA-loxP载体为基础,构建两个植物表达载体。其中一个采用Intein介导的蛋白拆分技术,命名为pNCre-CCre;另外一个载体是将Cre蛋白进行直接拆分,命名为pN-C,将两个载体转化农杆菌C58C1,之后转化烟草。发现pNCre-CCre载体的GUS染色阳性率(31.3%)显著高于pN-C载体的GUS染色阳性率(20.1%),说明内含肽介导的蛋白拆分可以显著提高拆分后蛋白片段结构重建的效率。二、内含肽介导的Cre蛋白拆分在拟南芥杂交中的删除效率分析将重组酶Cre拆分后的N端与内含肽的N端融合,内含肽C端与重组酶C端融合,以载体pCA-loxP为基础,分别构建两个植物表达载体,命名为pCA-NCre-In和pCA-Ic-CCre。将载体转化野生型拟南芥,筛选单拷贝纯合体进行人工杂交,通过对杂交子代GUS染色和测定GUS酶活,我们发现,拆分系统运用于拟南芥杂交中,可以高效地删除外源基因,效率最高达到96.736%。三、建立能彻底删除所有外源基因的基因删除系统改良植物表达载体的构建,将所有外源基因构建在两个同向loxP位点之间,两个loxP位点两侧即是T-DNA的左边界和右边界。将构建的两个植物表达载体分别转化野生型拟南芥,筛选单拷贝纯合体,之后进行人工杂交。通过对报告基因GUS和GFP的检测,以及杂交子代中目的基因的扩增,我们发现在杂交子代拟南芥中,虽然多数情况是部分删除,即并不是每一个植物细胞都发生了删除,而是部分细胞或者部分组织发生了完全删除,但单独的N端和C端的完全删除是存在的。因此,该研究为基因删除系统在大田中的应用奠定了基础。