肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在中国是死亡率高居第三的恶性肿瘤。尽管,当前我们已经把手术切除确立为了治疗早期肝癌的一线治疗手段,并且辅助结合其他治疗方式帮助患者。但是肝癌患者们不仅饱受肝癌耐药之苦,同时还承担着较高的术后复发风险,以至于最终大多都以差预后和短生存期而结束。然而根据最新研究,人们把癌症的这种高复发率归咎于一群叫做肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的罪魁祸首。由于这群细胞不仅拥有肿瘤形成的始动能力和类似于胚胎干细胞的自我更新特性,还拥有高度的分化潜能,使得它们在肿瘤的耐药已经放疗耐受中发挥重要作用。先前的研究已表明:肿瘤干细胞与肿瘤的形成、转移、耐药以及术后复发密切相关。同时,伴随着关于肿瘤干细胞的研究越来越多,更多揭示了它的作用机制,一方面可以加深我们对于恶性肿瘤的研究和了解,另一方面也为我们战胜癌症提供了新的希望。我们课题组先前的研究已经证明了,转录因子Nanog是肝癌干细胞的一个干性指标,它可以在体内或者体外条件下,通过IGF-1信号通路来调控肝癌干细胞的自我更新能力。同时我们也发现这群Nanog阳性的肝癌干细胞是肝癌患者不良预后的重要病因,它们不仅能够维持肝癌的自我更新,还在肝癌形成以及分化中发挥重要作用。然而实际上,我们无法阐明肝癌干细胞在肝癌的发生发展以及复发中作用的详细机制。去乙酰化酶sirtuin家族是一群高度依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的酶。该家族包含SIRT1-7 一共七个成员,已有研究表明它们参与调控了各种细胞生物学功能,例如:细胞周期、细胞代谢、细胞增殖、细胞分化、基因组稳定性以及肿瘤形成。同时,SIRT1也被证实在肝癌的维持以及发展中发挥关键作用。尽管人们发现在肝癌中microRNA (miRNA)-34a、miRNA-29c和c-MYC的表达能够有效调控致癌基因SIRT1的功能,但是SIRT1如何通过肝癌干细胞在肝癌中发挥作用,这个具体的调控机制我们依旧不得而知。MEK1和MEK2属于丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKs)家族的成员,这种激酶能够特异性的磷酸化苏氨酸和酪氨酸残基进而激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基质。MEK1异常调控会引发很多疾病包括肿瘤。而且,研究发现MEK1在很多肿瘤形成过程中会呈现上调趋势。另一方面,MEK1信号通路通常被认为是肝癌维持和发展的一个重要因素。可是,关于MEK1信号通路如何调控肝癌干细胞自我更新的具体机制还有待于进一步探索。我们的此次研究便揭示了一个MEK1失活时在体内外条件下,能通过促进SIRT1泛素化来加速其蛋白降解,进而抑制肝癌干细胞肿瘤形成能力的重要作用机制。为了达到此项研究目的,我们将这个课题分为四步来完成。首先,我们证明了 MEK1信号通路在肝癌干细胞自我更新和增殖中发挥重要作用:然后,我们又发现了在肝癌患者中MEK1的表达水平与SIRT1正相关,同时我们在肝癌干细胞中抑制或者敲除MEK1之后会导致SIRT1的明显下调;接下来我们又阐明了 MEK1对SIRT1的调控是通过维持其蛋白水平降解而达到的,也就证明了 MEK1信号通路是通过维持SIRT1蛋白水平来调控肝癌干细胞的自我更新的;最后,我们还惊喜的发现了 MEK1和SIRT1蛋白的共表达水平与患者的预后密切相关。本篇文章的主要结果及结论如下所示:1.在肝癌干细胞中抑制MEK1的活性可以有效地减慢其细胞增殖能力(1)我们将Huh7-Nanogpos和PLC/PRF/5-Nanogpos的肝癌干细胞以1×103每孔的密度铺在96孔板中,并用不同浓度的U0126进行持续处理6天,然后进行CCk-8检测。我们发现U0126能够显著抑制肝癌干细胞的增殖,而且这种抑制效果表现出浓度依赖的模式。同时,细胞生存曲线排除了这些抑制浓度对于肿瘤干细胞的药物毒性杀伤作用。(2)我们将 Huh7-Nanogpos 和 PLC/PRF/5-Nanogpos 肝癌干细胞与 U0126 或者二甲基亚砜(DMSO)共培养48小时之后,免疫荧光(Immunofluorescence, IF)实验表明比起对照组U0126处理后的肝癌干细胞Ki-67表达水平显著下降。(3)将丁酸钠同步化处理后的Huh7-和PLC/PRF/5-Nanogpos肝癌干细胞用U0126或者二甲基亚砜(阴性对照)处理之后,细胞周期实验发现U0126处理,诱发了大量肝癌干细胞将细胞周期停滞在G0/G1期,同时还伴随着S期和G2/M期细胞的显著减少。2. MEK1抑制剂U0126能够明显地降低肝癌干细胞的自我更新能力(1)我们发现在肝癌干细胞中抑制MEK1活性后能够显著下调其克隆形成及成球能力,且此结论已在两个细胞系中得到重复验证。而与肝癌干细胞相反的是,低浓度的U0126处理并不能降低非肝癌干细胞的克隆形成及成球能力。(2)免疫印迹实验表明在肝癌干细胞中抑制MEK1活性后能够显著抑制干性指标例如SOX2、OCT4以及Nanog的表达。(3)当我们把U0126处理后的肝癌干细胞以不同浓度梯度1×102、1×103,、1×104皮下注入NOD-SCID小鼠后,发现相对于对照组其肿瘤形成及生长能力被显著抑制。3.敲除MEK1能显著抑制肝癌干细胞的自我更新和增殖能力(1)蛋白水平检测发现在肝癌干细胞中敲除MEK1后能显著下调MEK1及磷酸化ERK1/2的蛋白表达水平,但是ERK1/2的表达水平没有明显差异。(2)在肝癌干细胞中用两种不同的MEK1干扰慢病毒敲除MEK1后,发现其增殖能力被明显抑制。(3)在肝癌干细胞中敲除MEK1后能显著抑制肝癌干细胞的成球和克隆形成能力。(4)免疫印迹实验表明在肝癌干细胞中敲除MEK1后干性相关蛋白的表达例如Nanog、OCT4、c-Myc和SOX2都被明显抑制。4.抑制或敲除MEK1能显著降低SIRT1的表达(1)通过检测我们发现sirtuin家族中,只有SIRT1和SIRT7在肝癌干细胞中的表达水平高于非肝癌干细胞,然而用U0126抑制MEK1活性之后只有SIRT1的表达水平被降低了。(2)正如免疫印迹实验结果所示:U0126对于肝癌干细胞中SIRT1表达水平的下调作用不仅与药物作用时间正相关,还与药物作用浓度正相关。(3)另一种MEK1抑制剂PD98059同样证实了在肝癌干细胞中抑制MEK1活性能有效地降低SIRT1蛋白表达。(4)在肝癌干细胞中敲除MEK1后能有效地降低SIRT1蛋白表达水平。5. MEK1信号通路通过调控组蛋白去乙酰化酶SIRT1来促进肝癌干细胞的自我更新和肿瘤形成能力(1)在非肝癌干细胞中过表达SIRT1后能显著地提高其克隆形成及成球能力,但是通过抑制MEK1信号通路的活性能够有效地逆转这种激活效果。(2)在肝癌干细胞中抑制MEK1活性后,这群细胞的克隆形成及成球能力被显著抑制,然后通过过表达SIRT1蛋白水平能够恢复它们的克隆形成和成球能力。(3)在体内肿瘤形成模型中,注射了 MEK1活性抑制的肝癌干细胞的NOD-SCID小鼠其肿瘤形成能力比起阳性对照组差很多。同时,我们还发现通过过表达SIRT1水平能够部分恢复肝癌干细胞在NOD-SCID小鼠体内的肿瘤形成能力。6. MEK1信号通路是通过抑制SIRT1的泛素化水平来抑制蛋白酶体的降解作用,从而维持SIRT1蛋白的表达水平(1)我们将肝癌干细胞分为四组:一组为阴性对照即与二甲基亚砜共培养,一组为阳性对照即与蛋白酶体抑制剂MG-132共培养,一组与MEK1抑制剂U0126共培养,一组为MEK1敲除的肝癌干细胞。这四组细胞培养48小时后,同时加入放线菌酮(CHX)处理不同时间,最后检测SIRT1蛋白水平发现:相对于阴性对照,MEK1抑制或者敲除后,肝癌干细胞中SIRT1蛋白的降解速度明显加快,而抑制蛋白酶体后SIRT1蛋白的降解速度被显著减慢。(2)在肝癌干细胞中抑制或者敲除MEK1后,会激活蛋白酶体活性从而有效地促进SIRT1蛋白的降解。(3)免疫共沉淀实验(Co-IP)结果显示:在肝癌干细胞中抑制或者敲除MEK1后,SIRT1的泛素化状态被极大地提高,导致了SIRT1蛋白的降解。7.在肝癌患者中MEK1/SIRT1的高水平表达与其不良预后呈现显著的正相关关系(1)我们在148例肝癌患者的组织标本中,通过免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测了 p-MEK1、SIRT1和Nanog蛋白的表达水平。其中同时高水平表达p-MEK1/SIRT1的患者有48例,而同时低水平表达p-MEK1/SIRT1的患者有39例。通过卡方检验(Person chi-square test)统计分析发现P值为0.035,也就是说在肝癌患者中MEK1与SIRT1的表达水平是相关的。同样的方法也证实了 Nanog的表达水平与MEK1/SIRT1的表达在肝癌患者中是相关的,其中两个P值分别是0.013和0.038。(2)我们将回访搜集到的148例肝癌患者的临床病理信息进行统计和分析发现:MEK1/SIRT1的共表达高低状态与肝癌患者的年龄、性别、血清甲胎蛋白(AFP)水平、肿瘤间质增生、肿瘤坏死及肿瘤复发没有统计学关联;但是MEK1/SIRT1同时表达水平的高低与肝癌患者的肿瘤大小(p=0.012)、血管癌栓(p<0.001)、包膜浸润(p=p=0.048)和临床肿瘤分期(p<0.001)都具有显著的统计学关系。(3)我们将患者生存周期与预后联合MEK1和SIRT1的表达水平进行分析发现两者存在显著关联,同时高水平表达MEK1和SIRT1的肝癌患者比起低水平的患者往往预后更差。总而言之,我们的研究结果表明:1.在肝癌患者中MEK1表达水平与SIRT1表达水平显著相关,同时高水平表达MEK1/SIRT1的肝癌患者提示预后不佳和较短的生存期。2.激活MEK1信号通路能促进肝癌干细胞增殖、自我更新和肿瘤形成特征,敲除或者抑制MEK1能显著降低干性标记物的表达水平。3. MEK1信号通路是通过SIRT1蛋白表达来调控肝癌干细胞的增殖、肿瘤形成和自我更新。4. MEK1通过泛素化SIRT1控制蛋白酶体降解来维持SIRT1蛋白的表达水平。5.可以将MEK1/SIRT1作为判断肝癌患者情况的指标,同时MEK1信号通路可以作为一个治疗肝癌的潜在靶标。综上所述,本研究证明了无论在体内还是体外环境下,抑制或者干扰MEK1能够有效地减缓肝癌干细胞的肿瘤形成速度。同时,我们还证实了 MEK1信号通路是通过维持SIRT1蛋白水平来促进肝癌干细胞的自我更新和肿瘤形成。从机制上阐明了MEK1信号通路通过抑制SIRT1的泛素化水平来抑制蛋白酶体的降解,从而维持较高的SIRT1蛋白表达水平。肝癌患者临床预后数据分析表明:高表达MEK1和SIRT1的肝癌患者与预后不良相关。我们的研究提示MEK1-SIRT1可以作为一个重要的诊断指标,同时抑制MEK1可能是靶向肝癌干细胞治疗的一个潜在作用靶点。