香菇(Lentinus edodes)属担子菌纲、伞菌目侧耳科真菌,是著名的药食同源之品。香菇多糖是从香菇子实体中分离得到的最有效生物活性成分,具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂等多种药理作用。但由于香菇多糖分子量大,溶解度不高,空间结构复杂,并且抗肿瘤作用机制不明确,因而缺乏香菇多糖的结构与活性的相关性研究,在一定程度上限制了其临床应用。目前普遍认为香菇多糖是通过增强机体免疫力间接发挥抗肿瘤作用,所以在临床上香菇多糖仅作为免疫调节剂用于癌症的辅助治疗,且只有普通的注射制剂和片剂,剂型单一。而本课题组在前期研究中发现,香菇多糖除增强机体免疫力外,还可通过诱导肿瘤细胞凋亡直接抑制肿瘤细胞增殖发挥抗肿瘤作用,且香菇多糖几乎没有临床抗肿瘤化疗药物对自身免疫系统损伤的毒副作用。因此,进一步探讨香菇多糖非免疫途径的直接抗肿瘤作用机制,充分发掘香菇的药用价值,研制新型、低毒、高效的香菇多糖新制剂,对临床抗肿瘤的治疗具有重要意义。本论文以香菇子实体为原料,先后采用水提醇沉和碱提醇沉两种方法提取香菇粗多糖,并经脱色、超滤分级分离得到五种香菇多糖精制组分SLNT1、SLNT2、JLNT1、 JLNT2和JLNT3、采用化学分析和波谱分析对香菇多糖的纯度、一级化学结构和糖链构象进行研究。体外实验考察五种多糖组分对不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性,体内实验建立H22荷瘤小鼠模型,探讨其体内抗肿瘤活性和体内诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制,为研制香菇多糖新剂型,增加香菇多糖在临床上的适应症及其在食品保健领域的应用提供理论和实验基础。第一部分香菇多糖SLNT1、SLNT2、JLNT1、JLNT2和JLNT3的精制以河南西峡香菇子实体为原料,分别采用水提醇沉和碱提醇沉两种方法提取香菇粗多糖SLNT和JLNT,经H202脱色、超滤分级分离得到五种不同均一组分的香菇多糖SLNT1、SLNT2、JLNT1、JLNT2和JLNT3,并对其纯度进行鉴定。苯酚-硫酸法检测其糖含量分别为96.89%,98.64%,95.12%,97.32%和101.56%;高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定其相对分子质量依次为6.17×105Da、9.76×104Da、6.39×105Da、2.74×105Da和1.51×105Da；紫外扫描显示五种多糖均不含核酸和蛋白质。结果表明五种多糖性状良好,分子量均一,纯度较高,符合后续实验要求。第二部分香菇多糖的结构及糖链构象研究采用波谱分析和化学分析研究五种精制多糖组分的一级结构和糖链构象。红外光谱扫描确定多糖的特征吸收峰和糖残基构型；完全酸水解确定单糖组成：高碘酸氧化、Smith降解分析多糖中糖残基连接类型和比例；甲基化进一步验证其糖残基比例；采用刚果红实验,通过考察不同浓度NaOH溶液中SLNT1、SLNT2、JLNT1、JLNT2和JLNT3与刚果红形成复合物的最大吸收波长λmax变化,确定五种多糖组分的糖链构象。红外扫描显示SLNT1、SLNT2、JLNT1、JLNT2和JLNT3都有多糖类特征吸收峰,且为β-D-吡喃糖结构;单糖组成分析结果表明五种多糖均由葡萄糖组成；化学分析表明其分别含有末端、(1-6)、(1-4)、(1-3)和(1-3-6)连接类型糖残基,其中,(1-4)连接所占比例甚小,不计(1-4)连接,五种香菇多糖组分各连接所占的比例(1-3和1-3-6：1-6和末端)分别为3.48：1,0.84：1,2.85：1,2.69：1和2.92：1。根据以上结果推测,SLNT1、JLNT1、JLNT2和JLNT3都是以β-(1-3)-D-葡萄糖为主链、13-(1-6)-D-葡萄糖连接为支链的多糖,具有相似的结构。SLNT2中(1-3)连接所占比例较小,是以β-(1-6)-D-葡萄糖连接为主链,β-(1-3)-D-葡萄糖为支链的多糖结构。刚果红实验结果初步显示五种多糖组分都具有三股螺旋空间构象。第三部分香菇多糖体内外抗肿瘤活性研究采用MTT比色法考察五种香菇多糖SLNT1、SLNT2、JLNT1、JLNT2和JLNT3对小鼠肝腹水瘤细胞H22、人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721、人胃癌细胞MKN45的体外生长抑制作用。结果表明,SLNT1、JLNT1、JLNT2和JLNT3对四种肿瘤细胞的增殖均有不同程度的直接抑制作用,且呈剂量依赖关系。SLNT2由于结构差异,仅对H22和HepG2细胞表现出一定的抗肿瘤作用,对SMMC-7721和MKN45细胞增殖无抑制作用。体外实验说明不同组分的香菇多糖对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用有一定的选择性。同时,大分子量多糖SLNT1和JLNT1对肿瘤细胞的抑制作用要强于小分子量多糖(SLNT2、JLNT2和JLNT3)。体内实验采用体外抗肿瘤活性较好的SLNT1和JLNT1组分,考察它们对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用。采用皮下注射H22细胞建立荷瘤小鼠模型,并随机分为阴性对照组(腹腔注射等体积生理盐水,qd×10),香菇多糖SLNT1低、中、高剂量组(分别腹腔注射SLNT150mg/kg、100mg/kg、200mg/kg,qd×10),香菇多糖JLNT1低、中、高剂量组(分别腹腔注射JLNT150mg/kg,100mg/kg,200mg/kg, qd×10),阳性对照组(腹腔注射环磷酰胺25mg/kg, qd×10)。实验结束后计算脏器指数、抑瘤率,对H22肿瘤组织进行H-E染色观察凋亡细胞形态学变化,并检测小鼠血清中IL-2和TNF-a水平。实验结果表明SLNT1低、中、高剂量对H22实体瘤的抑制率分别为23.31%、39.85%和65.41%,呈剂量依赖性；JLNT1则分别为38.17%,61.07%和29.01%,中剂量抑瘤效果最好。与阴性组比较,两种香菇多糖组分都可显著提高H22荷瘤小鼠脾指数及血清中IL-2和TNF-α水平,对胸腺指数影响较小,无统计学差异,说明SLNT1和JLNT1可刺激宿主免疫组织增殖、分化,提高机体免疫功能。但CTX组脾指数和胸腺指数与阴性组比较,均显著下降。此外,与阴性组相比,CTX治疗还可显著降低小鼠血清中IL-2和TNF-a水平。实验结果表明CTX在肿瘤治疗中有免疫抑制作用。进一步对H22肿瘤组织进行H-E染色,形态学观察发现香菇多糖给药组和CTX组中都出现散在分布的凋亡细胞,并具有典型凋亡细胞形态学变化,如核染色质致密浓缩、核碎裂、形成凋亡小体等。由以上结果可推断香菇多糖可能通过增强免疫和诱导肿瘤细胞凋亡两方面发挥抗肿瘤作用。根据结构和抗肿瘤活性研究结果并结合相关文献报道,从主链结构、分子量和螺旋结构三方面对香菇多糖的结构和抗肿瘤活性的关系进行初步探讨。研究发现以β-(1-3)-D-葡萄糖为主链、β-(1-6)-D-葡萄糖连接为支链的香菇多糖SLNT1、JLNT1、 JLNT2和JLNT3较β-(1-6)-D-葡萄糖连接为主链的SLNT2抗肿瘤活性好；同一方法所提取的多糖中,高分子量多糖抗肿瘤作用较低分子量多糖强,即抗肿瘤活性SLNT1>SLNT2, JLNT1>JLNT2>JLNT3;对香菇多糖高级构象考察发现三螺旋结构的香菇多糖解体为单链构象后,抗肿瘤活性会减弱,表明三螺旋结构的空间构象是香菇多糖发挥抗肿瘤作用的重要因素。第四部分香菇多糖SLNT1诱导肿瘤细胞凋亡分子机制研究根据体内动物实验结果,进一步选择水溶性好、易吸收的SLNT1组分,研究其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。在SLNT1体外诱导细胞凋亡活性的实验中,通过Annexin V-FITC/PI双染色法检测香菇多糖对不同肿瘤细胞(H22、HepG2、MCF-7)的凋亡率,Hoechst33258、AO/EB、Annexin V-FITC/PI染色和扫描电镜(SEM)观察不同浓度SLNT1对H22细胞凋亡形态的影响。SLNT1作用于H22、HepG2、MCF-7细胞后,通过流式细胞仪检测早期和晚期细胞凋亡率,发现SLNT1低(375μg/ml)、中(750μg/mL)高(1500μg/mL)剂量组诱导三种肿瘤细胞凋亡呈明显的剂量依赖性,高剂量组细胞凋亡率分别为24.0%、24.7%和17.5%,明显高于阴性对照组(P<0.05),表明SLNT1抗肿瘤作用机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现。AO/EB染色观察到香菇多糖SLNT1给药组H22凋亡细胞被染成橘红色或橙黄色,呈皱缩状,细胞核破裂；Hoechst33258染色可见H22细胞核呈致密浓染的块状蓝色荧光和细胞核碎裂等典型凋亡细胞核变化；Annexin V-FITC/PI双染色可见早期凋亡细胞被染成绿色,晚期凋亡细胞被染成红色,荧光较强,细胞通过发芽、起泡等方式形成一些大小不等、内含核碎片的凋亡小体：SEM结果显示凋亡细胞早期表面微绒毛逐渐消失,细胞表面出现皱缩,细胞开始变形,胞膜表面起泡、发芽形成凋亡小体。形态学观察结果进一步说明SLNT1有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。为探究SLNT1诱导肿瘤细胞凋亡的具体分子机制,首先采用流式细胞仪检测SLNT1对H22细胞周期分布的影响,并采用SLNT1与H22细胞共培养,DCFH-DA染色后,流式细胞仪检测H22细胞内活性氧(ROS)水平。其次,皮下注射H22细胞建立H22荷瘤小鼠模型,并随机分为阴性对照组(腹腔注射等体积生理盐水,qd×10),香菇多糖SLNT1低、中、高剂量组(分别腹腔注射SLNT150mg/kg、100mg/kg、200mg/kg, qd×10),阳性对照组(腹腔注射环磷酰胺25mg/kg, qd×10),实验结束后剥离肿瘤组织。蛋白质免疫印迹法(western blot)检测H22肿瘤组织中细胞凋亡信号转导通路中关键蛋白p-JNK、p-p38MAPK、p-Akt、p53和细胞周期蛋白cyclinB1、 cyclinD1、CDK4及线粒体通路蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达。结果显示SLNT1可使H22细胞周期阻滞于G2/M期,同时剂量依赖性升高H22细胞内ROS水平：与阴性组相比,SLNT1给药组肿瘤组织中p-JNK、Bax、p53和cleaved caspase-3表达增多,p-Akt、p-p38MAPK、Bcl-2、cyclinB1表达下降。根据实验结果总结分析,香菇多糖SLNT1诱导肿瘤细胞凋亡主要由ROS介导完成。SLNT1刺激H22细胞产生大量ROS后,可能会触发细胞凋亡信号转导通路诱导肿瘤细胞发生凋亡。其主要途径有：(1)上调p-JNK蛋白表达,增加p53含量,一方面直接激活caspase,另一方面作用于线粒体,增加Bax/Bcl-2的比例,促使细胞色素C释放进入胞浆,激活caspase级联反应,最终作用于caspase-3,启动凋亡程序。(2)抑制p38MAPK通路,下调p-p38蛋白表达,从而增加p53表达含量,产生以下两方面作用：①作用于线粒体,激活Bax,促使细胞色素C释放并激活caspase-3,导致DNA降解,诱导肿瘤细胞凋亡。②抑制细胞周期蛋白cyclinB1,使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期,抑制肿瘤生长。(3)抑制Akt通路,下调p-Akt蛋白表达,产生两方面作用：①增加p53表达,抑制细胞周期蛋白cyclinB1,破坏细胞周期进程,使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期,抑制肿瘤细胞增殖。②增加Bax/Bc1-2的比例,促进线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子AIF,诱导细胞凋亡。SLNT1诱导H22细胞凋亡的具体分子机制如下图所示：其次,体外考察香菇多糖SLNT1对微管蛋白聚合-解聚的影响。利用微管蛋白升温过程中(37℃)发生聚合形成微管,低温条件下(4℃)解聚成微管蛋白的特性,建立微管蛋白体外聚合-解聚平衡系统,考察加入阳性对照药物紫杉醇和香菇多糖SLNT1对其聚合解聚的影响。结果发现加入阳性对照药物紫杉醇后,可明显观察到紫杉醇促进微管蛋白聚合,抑制微管解聚SLNT1对微管蛋白的体外聚合过程也有影响,但其对微管的作用机理与紫杉醇相反SLNT1各剂量组可能通过抑制微管蛋白体外聚合,即抑制微管组装,诱导肿瘤细胞凋亡。为进一步证实香菇多糖可能通过抑制微管蛋白聚合诱导肿瘤细胞凋亡,采用SLNT1MCF-7细胞共培养,24h后,进行微管红色荧光探针和细胞核染色,于激光共聚焦显微镜下观察香菇多糖对MCF-7细胞骨架微管的影响。细胞免疫荧光结果显示香菇多糖能特异性抑制微管蛋白聚合。香菇多糖SLNT1低、中、高剂量组MCF-7细胞中仅在细胞核周围存在少量微管,微管不再呈网状向四周发散,且细胞体积缩小、变圆,细胞骨架被破坏。此外,香菇多糖给药组MCF-7细胞中大多可见细胞核固缩、呈新月牙形,出现凋亡细胞的典型形态学特征。实验结果表明,SLNT1能抑制微管蛋白聚合,阻止肿瘤细胞有丝分裂,从而阻滞肿瘤细胞周期于G2/M期,发挥抗肿瘤作用。