背景:肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人们的生命和健康,肝癌的转移是影响患者远期生存的主要因素。因此,深入研究肝癌转移的分子机制,对于寻找肝癌新的治疗靶点和改善肝癌患者预后具有重要的理论意义和实用价值。上皮间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要病理改变,是肿瘤发生转移的基础。EMT参与肿瘤转移的机制十分复杂且尚未阐明,进一步研究和阐释肝癌细胞发生EMT的具体分子机制对于防治肝癌转移非常重要。基因调控异常可导致包括肝癌在内的多种类型癌症的发生和发展,目前基因芯片等高通量生物技术联合生物信息学分析已被广泛用于从分子层面探索肿瘤的发生机制。本研究采用生物信息学技术筛选及临床样本验证,发现FEN1可能是肝癌发生发展过程中的关键基因。FEN1(Flap Endonuclease 1)是一种结构特异性核酸酶,参与DNA的复制、合成以及损伤修复,而且对维持基因组的稳定性至关重要。研究表明,FEN1在多种肿瘤组织中异常高表达并参与调控多种生物学进程。目前FEN1对肝癌生物学功能的影响及可能机制尚不清楚,因此,探讨FEN1对肝癌生物学功能的调控效应及其潜在机制对肝癌的防治具有重要意义。第一部分 基于生物信息学筛选及临床样本验证,FEN1在HCC中高表达并与肝癌转移相关目的:1.通过检索GEO数据库中肝癌基因芯片数据集,分析、筛选出与肝癌密切相关的核心基因。2.临床样本验证FEN1在肝癌组织中的表达情况,并分析其与临床病理参数的相关性。方法:1.通过检索GEO数据库下载肝癌相关的基因芯片数据集,GEO2R分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),Funrich软件对DEGs进行交集。2.DAVID(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)数据库对DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析。3.利用String数据库得到DEGs的蛋白互作网络图(protein-protein interaction network,PPI)并导入Cytoscape软件对PPI进行可视化,cyto Hubba插件分析枢纽基因(Hub gene),MCODE插件构建关键聚类模块(cluster)并对模块中的基因进行GO和KEGG分析,cyto Hubba插件分析出最关键cluster中的核心基因。4.UCSC Cancer Genomics Browser分析核心基因在TCGA肝癌组织中的聚类及表达情况,GEPIA数据库验证核心基因的表达并分析其与肝癌患者生存预后的关系。5.cbioportal数据库分析核心基因的PPI并筛选出有互作关系的核心基因,通过UCSC TCGA肝癌数据库分析其组织表达的相关性。6.Oncomine联合Firebrowse数据库分析FEN1在肿瘤组织包括肝癌的表达情况。7.免疫组化和RT-q PCR检测FEN1在肝癌组织中的表达差异,并分析与临床病理参数的相关性。结果:1.本研究通过筛选、分析GEO数据库中4个肝癌基因芯片数据集(GSE14520,GES29721,GSE60502,GSE45267)共得到409个DEGs,其中142个表达上调,267个表达下调。2.GO分析结果显示:表达上调的DEGs的生物学过程(biological process,BP)主要与细胞分裂、细胞周期、DNA复制等相关;细胞组分(cellular component,CC)分析显示主要参与核浆、细胞核、细胞浆等组成;生物学功能(molecular function,MF)分析显示主要有蛋白质的结合、ATP结合、DNA解螺旋酶活性以及染色质结合等功能。而表达下调的DEGs的BP分析显示主要参与氧化还原过程、细胞色素450通路及生长的负调控等过程;CC分析结果显示参与细胞外泌体、细胞器膜等组成;MF结果显示有氧化还原酶活性、单氧酶活性等功能。KEGG信号通路分析显示:表达上调的DEGs主要富集在细胞周期、DNA复制、P53信号通路、肿瘤通路等,而表达下调的DEGs主要富集在代谢通路、脂肪酸降解、化学致癌、PPAR信号通路等。3.String数据库联合Cytoscape软件可视化DEGs的PPI,cyto Hubba共筛选出185个Hub genes,MCODE插件共筛选出三个聚类模块(cluster1-3)。4.对三个模块分别进行GO和KEGG分析,BP结果显示cluster 1主要参与细胞分化、DNA复制等;cluster 2主要参与纤溶酶原激活物、补体活化调节等;cluster 3主要参与类固醇代谢、外源性药物分解代谢等过程。CC结果显示cluster 1主要参与核浆、细胞核等组成;cluster 2主要参与外泌体、胞外区等组成;cluster 3主要参与细胞器膜、内质网膜等组成。MF结果显示cluster 1主要有蛋白结合、DNA结合等功能;cluster 2主要有肽链内切酶活性、转录因子结合等功能;cluster 3主要有氧结合、血红素结合等功能。KEGG分析结果如下:cluster 1主要富集在细胞周期、DNA复制、P53信号通路等;cluster 2主要富集在补体系统等;cluster 3主要富集在化学性致癌、代谢通路等。5.对与肿瘤密切相关的cluster 1进行cyto Hubba分析,并将12种不同算法所得到的前40个基因进行交集,最终得到9个核心基因:BIRC5、DLGAP5、DTL、FEN1、KIAA0101、KIF4A、MCM2、MKI67、RFC4。UCSC Cancer Genomics Browser数据库显示9个核心基因在肝癌组织中均高表达,GEPIA数据库结果与此一致,且9个核心基因的高表达均提示肝癌患者不良预后。cbioportal数据库分析核心基因的PPI显示FEN1、MCM2、RFC4及BIRC5之间存在互作关系,且FEN1与MCM2或RFC4或BIRC5在肝癌组织中的表达均显著正相关。6.Oncomine和Firebrowse数据库显示FEN1在多种肿瘤组织中均显著高表达,包括肝癌,另外Oncomine显示FEN1在3个不同肝癌数据集中均显著高表达。7.免疫组化结果表明FEN1在肝癌组织中的显著高表达,其表达与肿瘤大小及转移状态显著相关,RT-q PCR结果显示肝癌组织中FEN1较癌旁显著升高,且发生转移的肝癌组织中FEN1的表达较非转移组明显升高。结论:筛选出9个肝癌相关的核心基因,其中FEN1在肝癌中高表达并与肝癌转移相关。第二部分 FEN1对肝癌细胞侵袭、迁移以及EMT的调控效应目的:1.检测FEN1在6种不同肝癌细胞及正常肝细胞HL7702中的表达水平。2.探讨FEN1对肝癌细胞侵袭、迁移及EMT的调控作用。方法:1.我们首先采用RT-q PCR和Western blot检测FEN1在6种肝癌细胞系(SK-HEP-1、MHCC-97H、Hep G2、SMMC-7721、HCCLM3、Huh7)和正常肝细胞HL7702中的m RNA和蛋白表达水平。2.采用慢病毒敲减和过表达载体转染SMMC-7721细胞,嘌呤霉素筛选稳定细胞株,RT-q PCR和Western blot验证稳定过表达和敲减FEN1的肝癌细胞系成功构建。3.划痕愈合实验及Transwell小室侵袭/迁移实验检测FEN1过表达或敲减后肝癌细胞侵袭迁移能力的改变。Western blot检测EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)、MMP2以及MMP9的表达差异。4.构建裸鼠皮下成瘤模型和尾静脉肝癌转移模型,探讨FEN1对裸鼠移植瘤的生长及肝癌肺转移的影响,免疫组化检测FEN1对瘤体组织EMT标志物的影响。结果:1.6种肝癌细胞中FEN1的表达显著高于正常肝细胞HL7702。2.成功构建FEN1稳定敲减和过表达的肝癌细胞株。3.FEN1敲减抑制SMMC-7721侵袭和迁移能力,阻滞EMT进程及下调MMP2、MMP9的表达;过表达FEN1则可以得到相反结果。4、FEN1敲减抑制裸鼠肿瘤生长,减少SMMC-7721细胞的肺转移,而过表达FEN1可以加速裸鼠皮下瘤的生长并促进肝癌肺转移。免疫组化结果提示FEN1敲减可以体内抑制EMT进程,而过表达FEN1可以促进EMT进程。结论:体内外实验证实FEN1可以促进肝癌细胞EMT。第三部分 miR-140-5p靶向调控FEN1抑制肝癌EMT目的:1.寻找调控FEN1表达的上游micro RNA。2.验证miR-140-5p能否靶向调控肝癌细胞FEN1的表达。3.讨论miR-140-5p是否参与FEN1对EMT的调控。方法:1.通过Target Scan数据库预测调控FEN1的micro RNA。2.双荧光素酶报告基因检测miR-140-5p能否结合FEN1的3’-UTR区。3.首先通过慢病毒转染构建稳定过表达miR-140-5p的肝癌细胞SMMC-7721和MHCC-97H,然后对稳定过表达miR-140-5p的肝癌细胞系进行miR-140-5p inhibitor转染,RT-q PCR检测miR-140-5p表达水平,RT-q PCR和Western blot检测FEN1的表达变化。4.RT-q PCR检测miR-140-5p在肝癌组织中的表达情况,并分析其与FEN1是否存在组织相关性。另外,KM-plotter数据库分析miR-140-5p表达与肝癌患者生存预后的关系。5.对过表达FEN1的SMMC-7721和MHCC-97H细胞进行miR-140-5p转染,Transwell小室实验检测miR-140-5p对FEN1调控肝癌细胞侵袭、迁移能力的影响,Western blot检测miR-140-5p对FEN1调控EMT的影响。6.对过表达FEN1的SMMC-7721和MHCC-97H细胞进行miR-140-5p转染,构建裸鼠皮下成瘤模型,体内验证miR-140-5p对FEN1调控肿瘤生长及EMT的影响。结果:1.Target Scan数据库显示miR-140-5p可能参与FEN1的转录调控。2.双荧光素酶报告基因结果显示miR-140-5p可以结合野生型FEN1的3’-UTR区,而对突变型FEN1的3’-UTR区无作用。3.RT-q PCR结果显示成功构建miR-140-5p过表达的肝癌细胞株,而miR-140-5p inhibitor可以显著抑制miR-140-5p的表达,RT-q PCR和Western blot结果显示miR-140-5p可以抑制FEN1表达,而miR-140-5p inhibitor可以回复FEN1的表达。4.RT-q PCR结果表明miR-140-5p在肝癌组织中的低表达,且发生转移的肝癌组织中miR-140-5p表达水平明显低于未发生转移的肝癌组织,相关性分析提示肝癌组织中FEN1与miR-140-5p表达负相关(r=-0.465,P=0.034)。KM-plotter数据库显示miR-140-5p低表达预示肝癌患者不良预后。5.Transwell小室实验表明miR-140-5p可以减弱FEN1对肝癌细胞侵袭、迁移和EMT的促进作用。6.裸鼠皮下成瘤模型显示miR-140-5p可以减弱FEN1对皮下瘤生长的促进作用及FEN1对EMT的诱导作用。结论:miR-140-5p靶向调控FEN1抑制肝癌EMT。第四部分 TGFβ1通过抑制miR-140-5p上调FEN1调控肝癌EMT目的:1.验证TGFβ1对EMT的调控效应。2.探讨TGFβ1对miR-140-5p和FEN1的调控效应。3.验证TGFβ1抑制miR-140-5上调FEN1进而参与调控EMT。方法:1.10 ng/ml的TGFβ1处理肝癌细胞系中48 h后观察细胞形态学变化,Western blot检测EMT标志物和FEN1表达变化,RT-q PCR检测miR-140-5p和FEN1表达变化。2.TGFβ1处理肝癌细胞同时敲减FEN1表达,Western blot检测EMT标志物和FEN1表达变化。3.TGFβ1处理肝癌细胞同时过表达miR-140-5p,Western blot检测EMT标志物和FEN1表达变化。结果:1.TGFβ1作用肝癌细胞48小时后,肝癌细胞形态明显变成纤维状,EMT标志物中E-cadherin表达下降,而N-cadherin、Vimentin表达升高。2.RT-q PCR显示TGFβ1可以下调肝癌细胞miR-140-5p表达而上调FEN1表达,Western blot结果显示TGFβ1可以促进FEN1蛋白表达。3.FEN1敲减可以抑制TGFβ1对EMT的诱导作用。4.miR-140-5p可以减弱TGFβ1对EMT的诱导作用,同时抑制TGFβ1对FEN1的正向调控。结论:TGFβ1通过抑制miR-140-5p上调FEN1促进肝癌EMT。