【摘 要】
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鉴于大肠杆菌表达胰岛素原时往往形成包涵体,造成后续制备工艺步骤繁琐,收率降低；而酵母表达系统存在诸多不稳定因素。本文工作以大肠杆菌为表达系统,通过优化影响表达的各种
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鉴于大肠杆菌表达胰岛素原时往往形成包涵体,造成后续制备工艺步骤繁琐,收率降低；而酵母表达系统存在诸多不稳定因素。本文工作以大肠杆菌为表达系统,通过优化影响表达的各种因素,实现人胰岛素原类似物在大肠杆菌中的可溶性表达。采用融合蛋白表达形式,设计编码框架,借助pET-28a载体引入his-tag纯化标签和GB1标签,并在标签与目的蛋白之间插入赖氨酸,便于后续步骤中标签的切除。同时,将C肽缩短为RRKR来提高表达量和A、B链的重组效率。对于基因的序列也进行了优化,在确保没有连续过长的RNA颈环二级结构的情况下,根据大肠杆菌偏爱性密码子,人工合成人胰岛素原类似物基因序列。然后,将得到的序列克隆到本室保存的表达载体pET-32a、pNJUTRX-1、pSYPU-1b中,经过可溶性分析后筛选获得表达量较高的重组体并优化发酵条件,以期进一步提高表达量。发酵条件主要从培养温度、诱导时间、IPTG用量、接种量这四方面考虑,获得最优发酵条件,为下一步分离纯化提供样品。纯化过程中,首先利用所带标签通过金属螯合层析,得到粗产品。通过胰蛋白酶酶切得到胰岛素后再次利用金属螯合层析纯化,所得组分基本达到电泳纯。
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