【摘 要】
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目的:颌骨缺损是目前人类常见的一类医学疾病,如何治疗骨缺损及加速骨组织再生是面临的一大医学难题,目前常用的自体移植与异体移植因来源有限、供体损伤及免疫排斥而受限。骨组织工程通过在骨缺损区域创建活跃的人工成骨微环境而成为骨移植的新型替代方法,其核心要素为生物支架材料。水凝胶技术是组织工程和可再生医疗等领域研究的热点,水凝胶技术具有与人体细胞外基质相似的高含水率及优异的仿生性能,是理想的三维细胞培养系
【基金项目】
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山西应用基础研究项目“用于引导性骨再生技术的具有不同二级结构的丝素/氧化石墨烯复合膜的研究”（编号:201701D221065）； 山西医科大学博士启动基金项目“用于种植位点骨缺损修复的丝素/羟基磷灰石/氧化石墨烯多孔支架的研究”（编号:BS03201638）； 山西重点研发计划项目“用于骨修复的丝素/羟基磷灰石/氧化石墨
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目的:颌骨缺损是目前人类常见的一类医学疾病,如何治疗骨缺损及加速骨组织再生是面临的一大医学难题,目前常用的自体移植与异体移植因来源有限、供体损伤及免疫排斥而受限。骨组织工程通过在骨缺损区域创建活跃的人工成骨微环境而成为骨移植的新型替代方法,其核心要素为生物支架材料。水凝胶技术是组织工程和可再生医疗等领域研究的热点,水凝胶技术具有与人体细胞外基质相似的高含水率及优异的仿生性能,是理想的三维细胞培养系统和细胞输送系统。包裹在水凝胶内的细胞可以很容易地从靶区被注射到患者体内,从而避免额外开放性手术,并使患有不规则的、深或封闭缺损的病人和患者更好地受益。由丝素蛋白（Silk fibroin,SF）制备的水凝胶因为它们具有自然安全、生物相容性好、降解速率可控、可与其他材料复合等优点而受到广泛关注,它们在我国现代生物医疗技术中有着广泛的应用前景。然而,传统的丝素蛋白水凝胶网络结构简单,功能单一,对复杂的应用环境适应性较差。大大的限制了它的应用及发展。本文的主要研究成果以丝素蛋白、氧化石墨烯（Graphene Oxide,GO）为主要原料,采用酶催化交联结合法制备了一种可注射的SF/GO复合水凝胶。通过改变GO的含量,形成多组凝胶材料,研究不同GO浓度的复合凝胶在理化性能、体外细胞相容性及成骨等方面的不同。通过改变复合凝胶中SF/GO的比例,优化复合凝胶的性能,同时探讨该复合凝胶作为骨组织修复支架材料的可行性。方法:本研究采用酶催化交联的方法制备了SF/GO复合水凝胶,研究GO的添加比例对复合凝胶理化性能的影响。通过扫描电镜（Scanning Electron Microscope,SEM）、傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared,FT-IR）、X光光电子衍射（X-ray diffraction,XRD）、X射线光电子能谱技术（XPS）、万能材料试验机和排液法对支架的形貌、支架的二级结构、元素的化学结构状态、力学性能、孔隙率进行宏观表征和分析比较,探讨GO含量对复合凝胶性能的影响。此外将骨髓间充质干细胞（BMSCs）包裹于凝胶内,通过激光共聚焦显微镜（LSCM）及CCK-8法检测包裹于SF/GO水凝胶内的BMSCs在凝胶化的过程中细胞的存活及增殖情况,评价材料的体外细胞相容性。最后,将骨髓间充质干细胞接种于凝胶内进行成骨诱导分化7、14、21天,通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）细胞染色及活性测定,茜素红染色（alizarin red S,ARS）及钙(Ca2+)半定量分析,评价成骨材料的体外细胞生长及成骨诱导能力。结果:1、加入HRP/H2O2交联剂后,SF/GO混合液迅速形成形态类似果冻的凝胶。随着GO质量分数的增加,复合凝胶的形成时间逐渐延长（SF组14.25±4.5,SF/0.05%GO组17.75±2.2,SF/0.1%GO组18.5±2.3,SF/0.2%GO组24±3.6,SF/0.4%GO组24±4.2）。SEM结果显示,丝素溶液与氧化石墨烯溶液良好融合,没有发现相分离,每组凝胶材料内部均是互相贯通的多孔结构,孔的大小与形态随着氧化石墨烯添加比例的不同而有所差异,氧化石墨烯的含量越高,复合凝胶的孔径越小（SF组90.49±0.74,SF/0.05%GO组92.36±0.57,SF/0.1%GO组92.64±0.81,SF/0.2%GO组93.13±0.22,SF/0.4%GO组93.24±0.89）。XRD与FT-IR结果表明,随着GO含量的增加,复合凝胶中不规则卷曲结构逐渐减少,β片状结构含量逐渐增加。XPS结果表明,与SF水凝胶相比,SF/GO复合凝胶内C/O比例增加,N/O比例几乎不变。压缩力学测试结果表明GO的加入显著提高了水凝胶的压缩破坏强度及破坏应变。2、体外细胞实验表明,包裹在凝胶内的细胞均匀、立体地分布在胶体支架内并保持良好的细胞形态,经过一段时间的培养,可见凝胶内的细胞活力尚可,且明显增殖,其中,与其他组相比SF/0.05%GO组水凝胶内细胞生长情况最好。体外成骨诱导分化培养实验结果表明,包裹在凝胶内的细胞用成骨诱导培养基培养7天及14天后,四组细胞均可见到一定的成骨分化,碱性磷酸酶呈上升趋势,茜素红染色结果与碱性磷酸酶染色结果相似,且与其他几组材料相比,SF/0.05%GO组ALP活性表达及钙盐沉积情况较其他组更好。（P<0.05）结论:综上,我们利用SF和GO两种材料,采用酶交联的方式,成功制备了包裹SF/GO复合凝胶。随着GO的加入,支架的孔径变得更加规整,孔隙率变化较小,力学性能得到一定的提升,此外,将BMSCs包裹在凝胶中,与不含或含有高浓度GO的SF水凝胶相比,低浓度GO的复合凝胶具有更好的细胞生长、增殖和成骨分化能力。因此,该可注射BMSCs水凝胶是一种很好的新型生物医学合成材料,在骨组织工程领域具有潜在的应用市场及发展前景。
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