丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。据WHO估计，目前全世界约有1.8亿HCV感染者，且呈增长趋势。HCV是单股正链RNA病毒，HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高达75％～85％，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对人类的健康和生命构成了严重威胁。 丙型肝炎病毒属黄病毒属，全长约9.6kb，为一单股正链RNA，分为5’非翻译区(UTR)、一个开放读码框(ORF)和3’非翻译区，编码一个由3000多个氨基酸组成的复合蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解产生至少10种基因产物：四种结构蛋白(core，E1，E2，p7)和六种非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。 而在HCV编码的十几种蛋白中，核心蛋白(core)是HCV多聚蛋白前体经细胞信号肽酶剪切而产生的非糖基化蛋白，由191个氨基酸组成。该蛋白的氨基酸序列十分保守，具有调控多种细胞基因，影响细胞生长、增生及凋亡的能力。 近年来外国学者在感染HCV的患者血清中发现了HCV-F蛋白，是由HCV核心基因编码的另一个产物，它是由核心基因密码子核苷酸移位后产生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者体内抗体的存在，显示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。 为了研究此种蛋白抗体在我国丙肝人群是否同样存在及其分布情况，探讨F抗体与HCV感染之间的关系。本文进行了如下研究： 第一部分：丙型肝炎病毒F蛋白重组基因片段的克隆及其在细菌中的表达 根据GENBANK提供的HCV1b序列设计引物，扩增F蛋白基因片段。PCR产物经过纯化后，与用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，电泳回收后与用上述双酶切割并电泳回收的pGEX-4T-2质粒连接，获得的重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞。PCR鉴定可扩增出与目的片段大小一致的DNA片段。同时提取重组质粒进行DNA序列测定与比对分析，结果证实DNA插入序列正确。对构建的重组工程菌用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳分析显示HCV-F/GST(Glutathione S-transferase)特异性表达产物的分子量约为43KD，表达量占菌体蛋白的15％左右。 本研究成功构建了表达丙型肝炎F蛋白重组基因片段的工程菌，为获得抗原性强、特异性好的F蛋白抗原奠定了基础。 第二部分：丙型肝炎病毒重组F表达蛋白的纯化与初步鉴定 将HCV-F/GST重组工程菌大量培养后加IPTG诱导表达，离心收菌并超声破碎后进行SDS-PAGE电泳检测，证实表达蛋白为可溶性蛋白。将超声裂解上清置入Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱中，用洗脱液(还原型谷胱甘肽)洗脱。收集洗脱下来的蛋白溶液，进行SDS-PAGE鉴定，并用紫外分光光度计测定蛋白浓度，于-30℃保存备用。 同时转化空质粒pGEX-4T-2入大肠杆菌，诱导表达GST蛋白，并进行Glutathione Seplaarose 4B亲和层析柱纯化。 将纯化获得的HCV-F/GST融合表达蛋白作抗原，稀释后包被酶联反应板， ELISA间接法检测已知的4份抗HCV阳性血清、4份正常人血清。结果显示此表达蛋白能与3份抗HCV阳性血清反应，而与1份抗HCV阳性血清和正常人血清不发生反应。同时Western blot分析也证实此蛋白抗原能与阳性血清抗体发生特异性结合。以上结果初步说明该融合表达蛋白制备、纯化较容易，并与丙肝病人血清出现特异性反应。 本研究建立了表达蛋白的纯化方法，并纯化获得了具有良好抗原性的HCV-F/GST蛋白抗原。 第三部分：用HCV-F/GST蛋白做为抗原检测丙肝病人血清抗体 将纯化后的重组表达蛋白HCV-F/GST作为抗原包被酶联反应板，以待测血清标本为一抗，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体为二抗，以GST蛋白孔作为本底对照，ELISA间接法分别检测120份抗HCV阳性血清、10份正常人血清。结果重组蛋白与82份的抗HCV阳性血清均可发生特异性反应(抗体阳性率68％)，而与10份正常人血清不起反应。病例组与对照组有统计学差异(p<0.01)。发现50岁以上年龄组抗HCV-F抗体的阳性率高于20～50岁年龄组，有统计学差异(p<0.01)；中重度和肝硬化患者阳性率最高(p<0.05)；抗HCV-F抗体在男性和女性患者中的检出无统计学差异；且与患者血清中HCVRNA的检出无统计学差异(P=0.099)，而在HCV RNA各型别之间的检出亦无统计学差异(P=0.926)。以上结果表明该融合表达蛋白具有较好的抗原性和特异性。 本研究建立了以ELISA间接法为基础的HCV-F/GST抗体检测方法，并对检测试剂、反应条件进行了优化。 第四部分：HCV-F/GST多克隆抗体的制备 将纯化后的重组表达蛋白HCV-F/GST作为抗原免疫BALB/c小鼠，取鼠尾血用间接ELISA法检测抗HCV-F抗体效价≥1:10 000。加强免疫后摘眼球取血，分离血清。Western blot分析证实此免疫后血清可与HCV-F/GST蛋白发生特异性结合，正常小鼠血清不与此蛋白发生反应。结果表明该免疫血清与HCV-F/GST有良好的免疫反应性，为进一步研究HCV-F蛋白在HCV感染和病程中的作用提供了实验基础。