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大果木莲(Manglietia grandis Hu et Cheng)是木兰科(Magnoliaceae)木莲属(Manglietia Bl.)植物,仅零星分布于我国云南东南部及广西西南部等局部地区,其种群数量日趋减少,濒临灭绝,已被列为国家二级重点野生保护植物和国家三级濒危保护物种。然而,目前国内外关于该物种的研究极少,基于此,本研究应用ISSR分子标记技术,对濒危植物大果木莲2个种群的遗传多样性进行了分析,并同广布近缘种中缅木莲种群的遗传多样性进行对比,旨在为揭示大果木莲这一珍稀濒危植物致濒的遗传学可能原因和为其有效保护提供科学依据。研究结果如下:
(1)采用单因素试验,测试了Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、5个因素对大果木莲ISSR扩增的影响,确立了在20μ L反应体系中,含TaqDNA聚合酶0.5U、dNTP0.2mmol/L、引物0.8μmol/L、Mg2+2.0mmol/L、1×PCR buffer2.0μL、DNA模板40ng。反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,50-60℃退火45s(不同引物的退火温度不同),72℃延伸2min,共40个循环:72℃延伸7min。
(2)筛选出9条ISSR引物对2个大果木莲种群和3个中缅木莲种群基因组DNA进行扩增,得到大小在120.1900bp之间的99条清晰显带,其中大果木莲有51(PPB为51.52%)条呈多态性,应用POPGENE软件进行分析,得到大果木莲的Shannon信息指数(I)是0.2715,Nei’s基因多样性指数(H)0.1830,这些指数在珍稀濒危植物种属于较高水平。近缘种中缅木莲的基因多样性稍高于大果木莲,有68(PPB为68.69%)条呈多态性。基因多样性为0.2429,Shannon多样性指数为0.3608。
不同种群间的分化水平(Gst)为0.1561,表明总的遗传变异中存在于种群间的只有15.61%,大部分的变异存在于种群内部。这与中缅木莲的情况相一致。
(3)根据ISSR结果构建的系统树,可以看出在大果木莲的2种群间存在一定的遗传分化,这与二者间较高的基因流相悖,这种情况的出现可能与大果木莲种群的进化历史、适应分化有关。另外,大果木莲和中缅木莲在遗传上已有明显的分化。根据ISSR结果构建的系统树,大果木莲2个种群分为一支,中缅木莲的3个种群分为另一支。
(4)从研究结果看,大果木莲的遗传多样性只稍低于中缅木莲,在珍稀濒危物种中多样性也属于较高水平,且种群的基因流较高(Nm=2.7030),说明其濒危原因中,不存在由于遗传多样性低而进化潜力和适应能力弱的因素。因此,要对大果木莲的生物学繁殖、生态学等角度进一步进行研究,找出致濒的主要原因。
(5)大果木莲的保护首先要加强其生境的保护,保存现存野生种群。然后要对其繁殖技术进行探究,扩大其个体数量。进而对大果木莲进行迁地保护,并注意在种群中分散取样,全面保护其遗传多样性。