[背景]肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是一组以肺血管阻力持续增加为特征的具有潜在破坏力的严重疾病,动脉型肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是PH的最常见类型之一。血管重构是PH发生发展的中心环节,目前PH的治疗药物虽可改善患者的临床症状,但不能抑制和逆转肺血管重构发生。近年研究发现,PH的发病与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ, PPARγ)表达降低相关,PPARγ的配体能够阻止或逆转PH的发生发展。罗格列酮是PPARγ的人工合成配体,具有抗炎、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡分化等作用。本研究拟通过野百合碱(monocrotaline, MCT)诱导PAH的大鼠模型,观察罗格列酮对野百合碱诱导PAH大鼠的治疗作用。[目的]通过观察罗格列酮对MCT诱导PAH大鼠一般状况、肺血流动力学及肺组织病理变化的影响,评估罗格列酮对MCT诱导的已形成PAH大鼠的治疗作用。[方法]1.实验动物分组：雄性Sprague-Dawley大鼠40只,随机分为4组,每组10只：①对照组(C组)：颈背部皮下注射生理盐水1次；②PAH模型组(P组)：颈背部皮下注射野百合碱(60mg/kg) 1次,并于注射后第21天至第34天连续给予等体积生理盐水灌胃(约1.5ml/d);③罗格列酮高剂量治疗PAH组(PRH组)：野百合碱(60mg/kg)颈背部皮下注射1次,并于注射后第21天至第34天连续给予罗格列酮(每日5mg/kg)灌胃；④罗格列酮低剂量治疗PAH组(PRL组)：野百合碱(60mg/kg)颈背部皮下注射1次,并于注射后第21天至第34天连续给予罗格列酮(每日2.5mg/kg)灌胃。2.于第35天行右心导管检查测定肺动脉平均压(mPAP)、右心室收缩压(RVSP);分离心脏,沿室间隔分离右心室,分别称量右心室、左心室+室间隔,计算右心室肥厚指数(RVHI)。3.肺组织切片HE染色及Elastin Van Gieson(ET+VG)染色,应用Image Pro Plus 6.0病理图像分析系统测定并计算各组大鼠肺小动脉管壁中膜厚度占管壁外径的百分比(WT%)。4.采用t检验及单因素方差分析比较组间差异,P<0.05为差异具有统计学意义,P<0.01为差异具有非常显著统计学意义。[结果]1.罗格列酮治疗对MCT诱导PAH大鼠一般情况的影响从注射MCT 2周后开始,P组、PRH组及PRL组的部分大鼠开始出现皮毛凌乱无光泽、呼吸急促、活动迟缓的表现,上述情况随时间延长而加重；从注射MCT3周后陆续出现大鼠死亡现象,C组、P组、PRH组及PRL组大鼠的病死率依次为0、50%、50%及30%;注射MCT 3周及5周后,C组大鼠体重分别为(386±14)g及(475±18)g;P组大鼠体重[(335±28)g,(316±28)g]、PRH组大鼠体重[(331±22)g,(320±43)g]及PRL组大鼠体重[(327±30)g,(296±41)g]均较C组大鼠降低,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01),而P组、PRH组及PRL组之间大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。2.罗格列酮治疗对MCT诱导PAH大鼠mPAP、RVSP及RVHI的影响C组大鼠mPAP、RVSP及RVHI依次为(21.66±2.43) mmHg, (43.76±3.64) mmHg及0.28±0.02；P组大鼠mPAP、RVSP及RVHI[(61.57±7.28) mmHg, (108.65±9.97) mmHg,0.70±0.03]:均较C组大鼠显著升高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01)；与P组大鼠比较,PRH组大鼠mPAP、RVSP、RVHI[(58.83±9.47) mmHg, (106.61±11.67) mmHg,0.63±0.07]和PRL组大鼠mPAP、RVSP、RVHI [(56.31±8.44) mmHg, (102.90±11.69) mmHg,0.63±0.07]虽略降低,但差异无统计学意义(P>0.05),且仍均显著高于C组大鼠(P<0.01)；PRH组和PRL组大鼠之间,mPAP、RVSP及RVHI差异均无统计学意义(P>0.05)。3.罗格列酮治疗对MCT诱导PAH大鼠肺小动脉重构的作用C组大鼠肺组织切片HE染色可见各级肺动脉管壁结构清楚,血管周围无炎症细胞浸润,ET+VG染色可见内外弹力板平滑无挤压；P组、PRH组及PRL组大鼠肺组织切片镜下表现相似,HE染色可见3组大鼠肌型肺小动脉管壁增厚,平滑肌增生肥厚,管腔狭窄,血管外膜肿胀,血管周围炎性细胞浸润,腺泡内肺微动脉“肌型化”,ET+VG染色可见内弹力板挤压呈“波浪状”改变。C组大鼠肺小动脉管壁中膜厚度占管壁外径的百分比(WT%)为(8.82±3.23)%,P组、PRH组及PRL组大鼠肺小动脉WT%[(55.22±5.72)%,(50.92±5.18)%,(52.45±6.45)%]均较C组大鼠显著增高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01)；而与P组大鼠相比,PRH组大鼠及PRL组大鼠WT%略降低,但差异无统计学意义(P>0.05)；不同剂量罗格列酮治疗组(PRH组及PRL组)大鼠WT%差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]1.罗格列酮治疗不能降低野百合碱诱导大鼠已形成的明显增高的肺动脉平均压和右心室收缩压。2.罗格列酮治疗不能逆转野百合碱诱导大鼠已发生的肺血管重构及右心室肥厚。[背景]肺动脉高压(PH)的发病机制极其复杂,至今仍未完全阐明。近年研究认为炎症和免疫机制在PH发生发展中起重要作用。罗格列酮属于噻唑烷二酮类药物(TZDs),是过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARy)的人工合成配体,其抗炎及免疫调节作用已在多种炎症疾病动物模型中得到证实。本研究拟通过野百合碱(MCT)诱导动脉型肺动脉高压(PAH)的大鼠模型,观察罗格列酮抗炎作用对早期肺血管病变的保护作用。[目的]1.通过观察大鼠一般状况、肺血流动力学及肺组织病理变化,评估早期应用罗格列酮对MCT诱导PAH大鼠的保护作用。2.通过测定MCT诱导PAH大鼠肺组织白细胞介素6 (interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor a, TNF-α)及单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)的变化,探讨早期应用罗格列酮对MCT诱导PAH大鼠炎症发病机制的影响。[方法]1.实验动物分组：雄性Sprague-Dawley大鼠32只,随机分为4组,每组8只：①对照组(N组)：颈背部皮下注射生理盐水1次；②PAH模型组(M组)：颈背部皮下注射野百合碱(60mg/kg) 1次,并于注射当天(第0天)开始给予等体积生理盐水(约1.5ml/d)连续灌胃21天；③罗格列酮高剂量干预PAH组(MRH组)：野百合碱(60mg/kg)颈背部皮下注射1次,并于注射当天(第0天)开始给予罗格列酮(每日5mg/kg)连续灌胃21天；④罗格列酮低剂量干预PAH组(MRL组)：野百合碱(60mg/kg)颈背部皮下注射1次,并于注射当天(第0天)开始给予罗格列酮(每日2.5mg/kg)连续灌胃21天。2.于第21天行右心导管检查测定肺动脉平均压(mPAP)、右心室收缩压(RVSP),颈内动脉插管测定体循环平均动脉压(MAP)；分离心脏,沿室间隔分离右心室,分别称量右心室、左心室+室间隔,计算右心室肥厚指数(RVHI)。3.肺组织切片行HE染色,做血管周围炎症评分；行Elastin Van Gieson (ET+VG)染色,测定并计算大鼠肺小动脉管壁中膜厚度占管壁外径百分比(WT%)；行a-SMA免疫组化染色,测定并计算腺泡内肺微动脉肌化百分比及a-SMA平均光密度值,评估非肌性血管肌化程度。4. ELISA方法测定肺组织匀桨IL-6、TNF-α和MCP-1水平。5.采用t检验及单因素方差分析比较组间差异,P<0.05为差异具有统计学意义,P<0.01为差异具有非常显著统计学意义。[结果]1.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠一般情况的影响注射MCT 2周后开始,M组的部分大鼠开始出现皮毛凌乱无光泽、轻微喘息、活动迟缓表现。分别于第1周、第2周、第3周时测定大鼠体重,N组大鼠体重依次为(287±12)g,(331±15)g及(375±19)g;M组大鼠体重[(261±17)g,(276±24)g,(319±29)]、MRH组大鼠体重[(268±8)g,(275±15)g,(328±14)g]及MRL组大鼠体重[(261±8)g,(284±11)g,(329±12)g]均较N组大鼠明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),而M组、MRH组和MRL组之间,大鼠体重差异均无统计学意义(P>0.05)。2.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠mPAP、RVSP、MAP及RVHI的作用MCT皮下注射3周后,N组大鼠mPAP、RVSP及RVHI依次为(17.13±3.30)mmHg, (40.33±5.77) mmHg及0.25±0.02；与N组大鼠比较,M组大鼠mPAP、RVSP及RVHI[(37.00±4.98) mmHg, (67.04±4.87) mmHg,0.40±0.02]均显著增高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01);MRH组大鼠及MRL组大鼠mPAP、RVSP、RVHI分别为[(26.88±3.55)mmHg, (50.09±5.61)mmHg,0.33±0.03]和[(28.29±3.60)mmHg, (55.71±4.85) mmHg,0.33±0.02],均低于M组大鼠,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01),但仍高于N组大鼠(P<0.01或P<0.05)；MRH组与MRL组大鼠之间mPAP、RVSP及RVHI无统计学差异(P>0.05)。N组、M组、MRH组及MRL组大鼠之间MAP[(87.81±7.78)mmHg,(88.23±9.29)mmHg,(90.17±6.82) mmHg, (89.88±9.08) mmHg]差异无统计学意义(P>0.05)。3.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺血管重构的作用光镜下观察肺组织HE染色切片可见M组大鼠肌型肺小动脉管壁明显增厚,平滑肌增生肥厚,管腔狭窄,腺泡内肺微动脉“肌型化”,并伴有肺泡间隔增宽,肺泡内巨噬细胞浸润。肺组织ET+VG染色可见M组大鼠肌型肺小动脉内弹力板挤压呈“波浪状”改变。N组大鼠WT%为(8.91±2.30)%,M组大鼠WT%[(45.52±5.48)%]较N组大鼠显著增高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01);而MRH组及MRL组大鼠WT%[(13.11±3.91)%,(16.70±1.68)%]较M组大鼠显著降低(P<0.01),其中MRL组大鼠WT%仍高于N组大鼠(P<0.05);MRH组大鼠WT%较MRL组进一步降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。肺组织切片a-SMA免疫组化染色显示：N组大鼠肺腺泡内微动脉肌化百分比及a-SMA平均光密度值分别为(19.91±2.27)%及0.22±0.04；与N组大鼠比较,M组大鼠肺腺泡内微动脉肌化百分比及a-SMA平均光密度值[(67.55±2.95)%,0.49±0.03]均显著升高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01)；MRH组大鼠、MRL组大鼠肺腺泡内微动脉肌化百分比及α-SMA平均光密度值分别为[(51.74±2.67)%,0.31±0.02]、[(54.73±2.39)%,0.38±0.03],均低于M组大鼠,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01),但仍高于N组大鼠(P<0.01)；MRH组大鼠肺微动脉肌化百分比较MRL组大鼠进一步降低,但差异无统计学意义(P>0.05),而MRH组大鼠α-SMA平均光密度值低于MRL组大鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺血管周围炎症的影响MCT注射3周后,M组大鼠肺组织切片HE染色显示肺小动脉周围有明显的炎症细胞浸润,N组大鼠肺小动脉周围炎症评分为0.40±0.16；与N组大鼠比较,M组大鼠肺小动脉周围炎症评分(3.24±0.41)显著升高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01)；与M组大鼠比较,MRH组大鼠及MRL组大鼠肺小动脉周围炎症评分(1.26±0.22,1.22±0.36)显著降低(P<0.01),但仍高于N组大鼠(P<0.01)；不同剂量罗格列酮干预组(MRH组和MRL组)大鼠之间肺小动脉周围炎症评分差异无统计学意义(P>0.05)。5.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺组织匀浆中IL-6、TNF-α和MCP-1水平的影响N组大鼠肺组织匀浆IL-6、TNF-α及MCP-1水平依次为(64.97±17.65) pg/ml, (56.51±14.92) pg/ml及(65.18±23.37) pg/ml; M组大鼠上述指标[(459.40±94.77)pg/ml, (436.46±62.20) pg/ml, (6265.53±2014.83) pg/ml]较N组大鼠均升高,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01)；MRH组大鼠和MRL组大鼠肺组织匀浆IL-6、TNF-a及MCP-1水平分别为[(102.94±45.28) pg/ml, (244.50±41.01) pg/ml, (979.28±428.71) pg/ml]和[(156.97±61.01) pg/ml, (249.92±61.23) pg/ml, (1107.56±408.32) pg/ml],均低于M组大鼠,差异具有非常显著统计学意义(P<0.01),其中TNF-a及MCP-1水平仍高于N组大鼠(P<0.01或P<0.05),而IL-6水平与N组大鼠差异无统计学意义(P>0.05)；MRH组大鼠肺组织匀浆IL-6、TNF-α及MCP-1水平较MRL组大鼠进一步降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]1.罗格列酮早期应用可以延缓野百合碱诱导肺动脉高压大鼠的肺动脉平均压和右心室收缩压的升高,其改善肺血流动力学的作用与剂量有关。2.罗格列酮早期应用能够延缓野百合碱诱导肺动脉高压大鼠的肺血管重构,减轻右心室肥厚,此效应与剂量有关。3.罗格列酮早期应用能够减轻野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺小动脉周围炎症,降低大鼠肺组织IL-6、TNF-a和MCP-1水平,可能与其对肺血管的保护作用有关。[背景]细胞外基质(extracellular matrix, ECM)重构是肺动脉高压(PH)主要的病理学特征之一。研究显示,ECM稳态的破坏与血管重构密切相关,而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制物组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)是ECM稳态的主要生理调节因子,已被证实在PH患者及动物模型的肺血管重构中发挥重要作用。近期大量体内外实验研究结果提示,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)参与了MMPs和TIMPs的调控过程。本研究拟通过野百合碱(MCT)诱导动脉型肺动脉高压(PAH)大鼠模型,观察罗格列酮早期干预对PPARγ的激动作用及对MMP-2、MMP-9和TIMP-1的影响,初步探讨其改善早期肺血管病变的机制。[目的]1.观察罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺组织PPARγ表达的影响。2.观察罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达及MMP-2、MMP-9活性的影响,初步探讨罗格列酮对PH的作用机制。[方法]1.实验动物分组：同第二部分。2.于第21天处死动物,留取肺组织。肺组织切片行PPARγ、MMP-2和MMP-9免疫组化染色,观察PPARγ、MMP-2和MMP-9在大鼠肺组织的定位表达情况。3.采用荧光定量PCR的方法,检测大鼠肺组织PPARγ、MMP-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA表达情况。4.采用明胶酶谱法,检测大鼠肺组织MMP-2及MMP-9的活性。5.采用t检验及单因素方差分析比较组间差异,P<0.05为差异具有统计学意义,P<0.01为差异具有非常显著统计学意义。[结果]1.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺组织PPARγ表达的影响免疫组化染色下,PPARγ阳性细胞主要分布于肺血管内膜,表现为细胞浆及细胞核染成棕黄色。N组大鼠肺小动脉内膜PPARγ部分表达,M组大鼠肺小动脉内膜PPARγ表达量降低,MRH组及MRL组大鼠肺小动脉内膜PPARγ表达量增高。荧光定量PCR法检测肺组织PPARγmRNA表达,N组大鼠肺组织PPARγmRNA表达为1.06±0.22,M组大鼠肺组织PPARγmRNA表达(0.57±0.07)较N组大鼠降低(P<0.05)；与M组大鼠比较,MRH组及MRL组大鼠肺组织PPARγmRNA表达[(1.98±0.39),(1.73±0.31)]显著升高(P<0.01),且均高于N组大鼠(P<0.01)；MRH组大鼠肺组织PPARy mRNA表达高于MRL组大鼠,但二者差别无统计学意义(P>0.05)。2.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达的影响免疫组化染色下,MMP-2、MMP-9阳性细胞主要分布于肺血管壁的内膜、外膜(中膜少量),表现为细胞浆呈棕黄色。M组大鼠肺小动脉MMP-2、MMP-9表达量较N组大鼠升高,MRH组及MRL组大鼠肺小动脉MMP-2、MMP-9表达量较M组降低。荧光定量PCR法检测各组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表达,N组大鼠上述指标依次为0.96±0.08,0.96±0.06,1.02±0.14;与N组大鼠比较,M组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表达(3.30±0.39,7.07±0.54,3.52±0.44)均显著升高(P<0.01)；MRH组大鼠及MRL组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA表达分别为(2.00±0.20,3.89±0.65,2.20±0.34)及(2.37±0.17,5.00±0.71,2.58±0.36),均低于M组大鼠(P<0.01),但仍高于N组大鼠(P<0.01)；MRH组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表达均低于MRL组大鼠,其中两组大鼠MMP-9表达的差异具有统计学意义(P<0.05),而MMP-2和TIMP-1表达的差异无统计学意义(P>0.05)。3.罗格列酮早期干预对MCT诱导PAH大鼠肺组织MMP-2、MMP-9活性的影响N组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9活性为40669.68±±4978.39,9511.13±3429.93。M组、MRH组和MRL组大鼠肺组织中MMP-2及MMP-9的活性分别为(54893.89±8480.12,23864.69±5121.83)、(52806.28±4759.47,14774.15±2392.96)和(53884.35±4688.02,16199.92±2933.85),均高于N组大鼠(P<0.01或P<0.05)；与M组比较,MRH组及MRL组大鼠肺组织MMP-9活性降低(P<0.01或P<0.05),而MMP-2活性虽较M组略降低,但差异无统计学意义(P>0.05)；MRH组大鼠肺组织MMP-2、MMP-9活性均低于MRL组大鼠,但差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]1.野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织PPARy mRNA表达下降,罗格列酮可激活PPARy而发挥肺血管保护作用,此效应与剂量有关。2.罗格列酮早期干预可降低野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织MMP-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA表达水平,此效应与剂量有关。3.罗格列酮早期干预可降低野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织MMP-9的活性(而非MMP-2),此效应与剂量有关。这提示罗格列酮可能主要通过调节MMP-9的活性,改善细胞外基质重构而发挥肺血管保护作用。