【摘 要】
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氮素是植物生长发育所必须的重要营养元素之一,氮素供给水平直接影响农作物的产量和品质。增加氮肥施用是农作物增产的主要手段。然而,随着氮肥施用量的逐年递增,作物产量却没有大幅度上升,反而带来土壤酸化、温室气体排放、水体富营养化和生产成本增加等问题。因此,大幅度提高作物氮素利用效率和培育氮高效品种是提高作物产量和减少氮肥过度使用的有效经济手段。木薯(Manihot esculenta)耐干旱、耐低氮,对
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氮素是植物生长发育所必须的重要营养元素之一,氮素供给水平直接影响农作物的产量和品质。增加氮肥施用是农作物增产的主要手段。然而,随着氮肥施用量的逐年递增,作物产量却没有大幅度上升,反而带来土壤酸化、温室气体排放、水体富营养化和生产成本增加等问题。因此,大幅度提高作物氮素利用效率和培育氮高效品种是提高作物产量和减少氮肥过度使用的有效经济手段。木薯(Manihot esculenta)耐干旱、耐低氮,对多种非生物胁迫具有较强的耐受能力。挖掘木薯相关氮高效利用关键基因,对于作物氮高效种质资源的改良和培育具有重要的意义。本研究首先通过生物信息学的方法对木薯硝酸盐转运蛋白MeNPF基因家族进行全基因组鉴定,系统分析了家族成员的系统发育关系、基因结构、蛋白保守基序、染色体定位、基因复制事件以及启动子顺式作用元件,并从木薯中克隆了MeNPF6.2和MeNPF6.3基因;综合运用转录组测序、实时荧光定量PCR、亚细胞定位、木薯和水稻过表达等技术,初步解析了MeNPF6.2的基因功能。主要结果如下:(1)从木薯全基因组水平上共鉴定得到72个MeNPF家族成员,均含有PTR2结构域。这些基因不均匀地分布在木薯的18条染色体上。共有21对大片段复制,无串联重复基因。参考拟南芥At NPF基因的分类和系统发育分析将木薯MeNPF基因分为8个亚家族(Ⅰ-Ⅷ),其中亚家族Ⅴ的MeNPF基因数量最多。同一亚家族具有相似的基因结构和蛋白保守基序。启动子顺式作用元件的预测结果表明MeNPF基因可能与激素和非生物胁迫的响应有关。(2)通过生物信息学方法对木薯MeNPF6.2和MeNPF6.3两个蛋白进行跨膜结构域和亚细胞定位分析,发现MeNPF6.2和MeNPF6.3均含有12个跨膜结构域,可能为细胞质膜蛋白。通过将基因-e GFP融合载体在烟草原生质体瞬时表达及在拟南芥稳定表达,验证了MeNPF6.2和MeNPF6.3定位于细胞膜上。(3)实时荧光定量PCR检测发现MeNPF6.3基因主要在木薯幼苗的根中表达,且在0.2mmol/L硝酸盐处理下表达量最高,在茎和叶中的表达量基本不受外界硝酸盐浓度的诱导;MeNPF6.2基因主要在叶片中诱导表达。表明这两个基因的表达均受硝酸盐诱导。(4)MeNPF6.2过表达转基因木薯的表型分析表明,在正常生长情况下,过表达株系长势明显优于未转基因对照,叶面积、根长和根数均显著提高;在低氮处理下,转基因株系和对照均受到一定程度的氮胁迫,但转基因株系表现出较强的耐低氮特性,其根长、根数以及叶面积均显著高于对照。(5)通过MeNPF6.2过表达转基因水稻株系的表型观察,发现转基因水稻与未转基因对照相比,粒长无明显差异,但粒宽显著高于对照,且百粒重也明显增加。(6)为了寻找MeNPF6.2的互作蛋白,构建酵母双杂交载体p BT3-N-MeNPF6.2,通过膜体系酵母双杂筛库技术初步筛选出三个互作蛋白,包括核糖体蛋白L7Ae/L30e/S12e/Gadd45家族蛋白(T24D18_3)、肌球蛋白1(MYA1)和阿拉伯半乳糖蛋白15(AGP15)。上述结果表明,MeNPF6.2基因在木薯响应低氮胁迫中起重要作用,过表达MeNPF6.2增强木薯低氮耐受性,在水稻中的异源表达提高了籽粒百粒重,可用于作物耐低氮改良。
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