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糖尿病是严重威胁人类健康的主要疾病之一,寻找高效抗糖尿病药已成为近年生物医学领域关注的热点问题之一。家蚕素(bombyxin,Bbx)是无脊椎动物中首个被鉴定的昆虫胰岛素,分子量约5KD,家蚕素Ⅱ的A链与B链与人类胰岛素具有高度同源性。在昆虫体内,家蚕素具有调节变态发育、参与糖代谢调控,促进造血器官细胞增殖以及卵巢发育等生理功能,但家蚕素对哺乳动物细胞糖代谢的作用未见报道。我们课题组的前期工作已经证实：从蚕蛾头部提取的胰岛素样生物活性物质ILAS在动物实验显示具有明显的降低糖尿病小鼠血糖的效果,但具体何种物质起降糖作用并不清楚,我们推测蚕蛾ILAS发挥抗糖尿病作用的核心成分很可能是家蚕素。因此本研究在前期实验基础上,应用基因工程重组技术进行家蚕素Ⅱ基因的表达,并体外观察表达的家蚕素Ⅱ蛋白对人肝癌细胞株HepG2细胞葡萄糖摄取和糖原合成作用的影响,从而确认家蚕素Ⅱ的胰岛素样作用。本研究分三部分：(1)家蚕素Ⅱ基因真核表达载体的构建和鉴定。应用基因合成方法先后合成野生型家蚕素Ⅱ基因(BbxⅡ)和突变型家蚕素Ⅱ基因(MBbxⅡ)的cDNA序列,其中在MBbx II序列中插入了Furin酶的识别位点,从而使其在非内分泌细胞中表达有生物学活性的成熟家蚕素；同时在两个基因片段的末端加入了表达六个组氨酸的基因序列,从而有利于表达蛋白的纯化与检测；在基因的前端为信号肽序列,有利于家蚕素在哺乳细胞内的分泌；以真核表达载体pcDNA3.1(+)为骨架,该质粒载体具有SV40病毒复制起点。应用基因工程重组技术分别将BbxⅡ基因与MBbx II基因克隆入pcDNA3.1(+)载体中；应用限制性内切酶与基因测序方法进行载体克隆正确性鉴定。(2)家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞中的表达。应用脂质体介导的基因转移技术分别将BbxⅡ基因与MBbx II基因导入293FT细胞,收集细胞与上清,应用RT-PCR与荧光定量PCR检测BbxⅡ和MBbx II在mRNA水平的表达；针对6个组氨酸标签,对转染后的293FT细胞进行免疫细胞化学检测,对转染后的293FT细胞和上清进行western blot检测,从而间接检测BbxⅡ和MBbxⅡ在蛋白水平的表达。(3)家蚕素Ⅱ胰岛素样作用的确认。以肝癌细胞株HepG2细胞为体外胰岛素样作用研究的靶细胞,将BbxⅡ、MBbxⅡ基因转染上清与人胰岛素分别作用于HepG2细胞,应用GOD-POD法检测葡萄糖消耗情况,应用PAS法检测糖原合成情况,观察家蚕素Ⅱ蛋白对HepG2细胞糖原合成作用的影响；将MBbxⅡ基因转染上清与不同浓度的PI3K特异性抑制剂wortmannin S1952共同作用于HepG2细胞,观察成熟家蚕素Ⅱ蛋白对HepG2细胞糖原合成作用的影响。本研究得出实验结果如下：1.成功构建野生型家蚕素Ⅱ和突变型家蚕素Ⅱ基因真核表达载体。经酶切及DNA测序鉴定,野生型家蚕素Ⅱ基因(BbxⅡ)与突变型家蚕素Ⅱ基因(MBbxⅡ)的cDNA已重组到pcDNA3.1(+)真核表达质粒载体中,且方向、序列完全正确,构建的载体分别简化命名为ZDL-B和ZDL-MB。本研究根据人类胰岛素基因在非内分泌细胞表达成熟胰岛素的原理,首次成功改造了突变型家蚕素Ⅱ基因,使其可以表达成熟的家蚕素Ⅱ蛋白,为后续研究家蚕素Ⅱ对哺乳动物细胞的胰岛素样作用奠定了实验基础。2.成功实现了重组家蚕素Ⅱ基因在293FT细胞内的表达。BbxⅡ基因和MBbxⅡ基因转染293FT细胞后,RT-PCR与荧光定量PCR检测结果均显示有明显的家蚕素Ⅱ基因mRNA的表达；免疫细胞化学检测结果显示在293FT细胞胞浆内可见染成棕黄色的阳性细胞；Western blot结果显示在293FT的上清和细胞内,均可以见到明显的蛋白条带,大小分别是10KD和5KD左右。上述结果表明BbxⅡ基因和MBbxⅡ基因转染后,在mRNA水平和蛋白水平均可在293FT细胞内获得表达。3.首次证实了突变型家蚕素Ⅱ对哺乳动物细胞具有胰岛素样作用。对家蚕素Ⅱ胰岛素样作用的研究结果表明：MBbxⅡ基因转染非内分泌细胞293FT细胞后,表达了成熟的家蚕素Ⅱ蛋白,该成熟蛋白促进了肝癌细胞株HepG2细胞的葡萄糖摄取与糖原合成作用。本研究中成熟家蚕素Ⅱ蛋白对HepG2细胞的葡萄糖摄取能力与10nM的人胰岛素能力相当。由于多年来一直未能证实家蚕素对哺乳动物细胞是否具有胰岛素样作用,因此本研究中成熟家蚕素Ⅱ蛋白对哺乳动物细胞糖代谢作用的影响,展示了开发抗糖尿病新药的前景。4.突变型家蚕素Ⅱ基因转染上清与PI3K特异性抑制剂wortmannin S1952共同作用于HepG2细胞后,HepG2细胞糖原合成减少,表明HepG2细胞糖原合成受到抑制,且随着I3K抑制剂浓度的增加,HepG2细胞糖原染色阳性细胞数减少,染色强度降低,这与人胰岛素对HepG2细胞合成糖原的影响一致。上述结果表明突变型家蚕素Ⅱ是通过PI3K信号传导途径发挥促进HepG2细胞糖原合成作用的,从而初步判断成熟家蚕素Ⅱ蛋白可能通过胰岛素受体发挥其胰岛素样作用,需要进一步实验证明。总之,通过上述研究结果阐明：通过基因重组技术将突变型家蚕素Ⅱ基因导入非内分泌细胞293FT细胞,表达的成熟家蚕素Ⅱ蛋白具有胰岛素样作用,促进了肝癌细胞株HepG2细胞葡萄糖摄取能力,与人胰岛素(10nM)对HepG2细胞葡萄糖摄取能力相当；促进了HepG2细胞糖原合成能力,初步判断其对糖原合成作用的影响是通过PI3K信号传导途径发挥作用的。本实验研究结果为深入探讨家蚕素Ⅱ对哺乳细胞的糖代谢调节作用,从而为开发新型的抗糖尿病药物奠定实验与理论基础。