结直肠癌是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,在全球发病率排第三,死亡率排第二。2018年全球约有180多万新发病例和88万死亡病例,约占癌症病例和死亡病例的十分之一。各国之间结直肠癌的发病率差异很大,发达国家的结直肠癌发病率约为发展中国家的三倍。这一疾病可被认为是社会经济发展的标志。随着国家人类发展指数(HDI)的增加,发病率也呈现出统一的上升趋势。评估最近十年结直肠癌发病率和死亡率的趋势,确定了与发展水平相关的3种不同的模式:发展中国家,如中国和巴西,随着生活习惯、饮食模式的改变和肥胖,结直肠癌的死亡率和发病率在上升;发达国家,如加拿大、英国、新加坡等,通过实施最佳的癌症治疗和管理模式,使结直肠癌的死亡率得到下降;而美国、日本、法国等国家,则通过早期检测和筛查,结直肠癌的死亡率和发病率都有下降趋势。但是结肠癌的发生发展机制仍不甚清楚,能够用于早期诊断、治疗和预测预后的生物标志物十分有限。因此,探究结肠癌的发生发展机制,寻找有效的生物靶标对于结肠癌的早诊断、早治疗、评估预后具有极其重要的意义。微小RNA(Micro RNAs,miRNA)是一种由内源基因(大约20个核苷酸长度)编码的单链非编码RNA,可通过与靶基因m RNA的部分互补位点结合而影响转录过程并影响细胞功能,起到促进癌症或抑制癌症的作用。此外,miRNA还可以通过降解m RNA来调节基因沉默。它具有复杂的调控网络,可以通过单个micro RNA调控多个靶基因的表达,也可以通过多个micro RNA的组合来精确调控某个基因表达。已经发现,多种miRNA在许多类型的肿瘤中有异常表达,这通常与患者的诊断,分期,进展,预后和临床疗效有关。ATOH1基因是果蝇基因Atonal的同源物,位于4q22号染色体上,可调节中枢神经系统和周围神经系统中神经细胞的功能。先前的研究发现,在结肠癌细胞中,可以通过上调ATOH1的表达来抑制细胞迁移和增殖从而延长G0/G1期。在本研究中,我们首先研究了miR-613在结肠癌中的作用,双荧光素酶报告证明了miR-613是ATOH1的上游miRNA。通过共转染miR-613和ATOH1证实ATOH1可逆转miR-613对结肠癌细胞的促进作用。然后通过Western Blot研究ATOH1调节的下游蛋白质,推测miR-613通过靶向下调ATOH1的表达,进而抑制JNK1通路,抑制抑癌蛋白MUC2的表达,最终导致结肠癌进展。因此,作为致癌基因,miR-613通过靶向ATOH1调控结肠癌的进展,并有希望成为临床治疗干预的靶标。第一部分结肠癌组织中miR-613的表达及生物学功能研究目的:初步分析miR-613在癌组织和癌旁组织中的差异,并通过体外试验探索分析miR-613对结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响。研究方法:收集20例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织,用qRT-PCR法检测结肠癌组织和癌旁组织中miR-613的表达。qRT-PCR法检测结肠癌细胞株中miR-613的表达。质粒转染构建下调miR-613和过表达miR-613的结肠癌细胞模型,qRT-PCR法检测结肠癌细胞株miR-613的表达。我们应用MTT法检测细胞增殖能力,应用划痕试验检测细胞迁移能力,应用Transwell试验检测细胞侵袭能力,阐明miR-613在结肠癌细胞中的生物学功能。研究结果:qRT-PCR检测结果表明结肠癌组织中miR-613表达上调。结肠癌细胞中miR-613的表达显著高于正常人结肠上皮细胞。MTT法检测证明,过表达miR-613能有效促进结肠癌细胞的增殖,而下调表达miR-613的结肠癌细胞增殖活性明显下降。Transwell试验证明,下调表达miR-613的结肠癌细胞株侵袭能力显著降低,而过表达miR-613的结肠癌细胞株的侵袭能力显著提高。划痕试验证明,下调表达miR-613的结肠癌细胞株迁移能力显著降低,而过表达miR-613的结肠癌细胞株的迁移能力显著提高。结论:miR-613在结肠癌组织中高表达,并能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第二部分miR-613靶向抑制ATOH1的表达及ATOH1对结肠癌预后价值的探究研究目的:通过体外试验分析miR-613的靶基因,并探寻miR-613对ATOH1的调控机制以及对结肠癌细胞的生物学行为的影响。研究方法:双荧光素酶检测报告证实ATOH1 m RNA与miR-613的结合位点。质粒转染构建下调miR-613和过表达miR-613的结肠癌细胞模型,qRT-PCR法检测结肠癌细胞株ATOH1 m RNA的表达,Western Blot法检测结肠癌细胞株中ATOH1蛋白的表达。免疫组化染色法评估结肠癌组织中ATOH1蛋白的表达并探究其与生存期的关系。qRT-PCR法测定结肠癌组织中ATOH1蛋白和ATOH1 m RNA的表达一致性。研究结果:双荧光素酶检测报告证实ATOH1是miR-613的靶基因。qRT-PCR的结果显示,下调miR-613的结肠癌细胞株中ATOH1 m RNA的表达水平显著升高,而过表达miR-613的结肠癌细胞中ATOH1 m RNA的表达水平显著降低。Western Blot法证实,下调miR-613能使ATOH1蛋白的表达水平显著升高,过表达miR-613组的ATOH1蛋白表达水平显著下降。免疫组化染色法证实,ATOH1在结肠癌组织和癌旁组织中都有阳性表达,在癌旁组织中表达高于癌组织,且在结肠癌组织中ATOH1高表达与较低分级和较低TNM分期显著相关。ATOH1表达阳性的患者总生存期更长。qRT-PCR法证实,结肠癌组织中的ATOH1 m RNA表达和ATOH1蛋白的表达方向一致。结论:ATOH1是miR-613的靶基因,miR-613能抑制ATOH1 m RNA和ATOH1蛋白的表达。ATOH1与结肠癌呈负相关,ATOH1表达阳性的患者总生存期更长。结肠癌组织中ATOH1 m RNA和ATOH1蛋白对肿瘤的影响是一致的。因此推断,能通过qRT-PCR法检测患者外周血中的miRNA-613的表达而早期诊断肿瘤并预测患者的预后。第三部分ATOH1抑制miR-613对结肠癌细胞的促进作用研究目的:回复实验验证ATOH1能逆转miR-613对结肠癌细胞生物学功能的促进作用。研究方法:将miR-613 mimic和/或ATOH1过表达质粒转染至HCT-116和Lovo结肠癌细胞,MTT法分别检测各组结肠癌细胞株的增殖能力,Transwell试验分别检测各组结肠癌细胞株的侵袭能力,划痕试验检测各组结肠癌细胞的迁移能力,Western Blot检测ATOH1下游标志蛋白的表达。研究结果:miR-613能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,而ATOH1能显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在miR-613和3’UTR缺失型ATOH1共转染时,ATOH1可逆转miR-613对结肠癌细胞株的增殖、迁移和侵袭的抑制作用。Western Blot结果表明,ATOH1对总的JNK1蛋白表达无显著改变,但可以提高其活化形式p-JNK1的表达,此外miR-613能抑制抑癌蛋白MUC2的表达。结论:ATOH1高表达是结肠癌患者的良好预后因素。ATOH1能显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-613通过靶向调控ATOH1促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,可能是通过抑制JNK1通路和抑制MUC2,最终导致结肠癌进展。第四部分体内试验验证miR-613靶向ATOH1对结肠癌生物学功能的影响研究目的:动物实验验证miR-613靶向调控ATOH1对结肠癌发生发展的影响。研究方法:将control、miR-613mimic、ATOH1、miR-613+ATOH1四组质粒转染的细胞分别接种于小鼠皮下构建成瘤模型,测量肿瘤体积,并称取肿瘤重量。研究结果:miR-613过表达的结肠癌细胞组,Balb/c Nod荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力明显高于空白对照组;ATOH1过表达组的Balb/c Nod荷瘤小鼠体内的肿瘤形成能力明显低于空白对照组,miR-613可靶向下调ATOH1对体内成瘤的抑制作用。结论:miR-613通过调控ATOH1表达可促进结肠癌在体内的发生和生长。