一、研究背景随着经济社会的发展,小儿各类疾病的病因、诊断和治疗研究不断完善,感染性疾病、先天性疾病的发病率和病死率明显降低。然而,儿童恶性肿瘤的发病率明显提高,成为儿童死亡的主要病因之一。在已经到来的分子生物学时代和精准医疗模式下,与成人比较,儿童恶性肿瘤病因、早期诊断及治疗的基础研究和应用明显滞后,影响了儿童肿瘤的精准诊断与治疗。因此明确儿童恶性肿瘤的发病进展机制,明确突变基因,找到有效肿瘤标记物,提高诊治水平,改善患儿生存率,减少治疗中近远期副作用的影响,已经成为目前社会迫切关注和需要解决的问题。肾母细胞瘤(Wilms Tumor)是一种肾脏的胚胎性恶性肿瘤,也是儿童最常见的泌尿生殖系统肿瘤,其发病率约占儿童实体肿瘤的14%,发病高峰年龄在1-5岁。虽然经过近50年手术、化疗及放疗等综合治疗方案的不断改进,Wilms Tumor生存率有明显提高,治疗后5年生存率达到了87%,但是一定数量的病例因肿瘤细胞间变、较晚的临床分期以及肿瘤破溃,表现出较高的复发率和远处转移率,导致了较差的预后。另外,由于缺乏有效的肿瘤标志物可能导致低危险度病例过度治疗以及高危险度病例治疗不足带来的严重并发症和不良后果。因此研究Wilms Tumor进展的发病机制,寻找密切相关的生物学指标是细化治疗方案、减少不良反应的重要步骤,也是改善患儿生存率和生活质量的关键。肿瘤的调控是一个庞大复杂的网络,涉及到许多调控通路。近年来,肿瘤的基础研究不断拓展,发现了许多与肿瘤发生、发展、侵袭和转移相关的调控通路,而且这些调控通路在早期诊断、肿瘤的分期和分级、治疗药物的开发以及预后的判断上提供了更加准确的标志,不仅更加深入的了解肿瘤发生的机制,更好地评估肿瘤的分级,提供了精准的治疗方案,增加了治疗方法,减少了并发症。但是目前,在Wilms Tumor中已经研究清楚的信号通路甚少,特别是信号通路下游的重要调控基因和元件,因此了解更多的信号通路的下游突变基因有助于掌握Wilms Tumor致病的机制和准确判断的标记物。转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)是目前已知的一类具有多种功能的生物学活性的细胞因子,也是其调控传导通路的起始因子,参与肿瘤的形成。作用的相关机制包括通过促进VEGF表达增强参与肿瘤新生微血管的生成；诱导免疫抑制和免疫逃避现象；在肿瘤转移级联反应过程中诱发上皮-间质转化,提高了肿瘤细胞的侵袭性和远处转移能力。TGF-β信号传导通路超家族是已知的最重要的参与机体多种生物学调控过程的信号通路之一,作用非常广泛,包括细胞增殖、分化、迁移和凋亡。在一些肿瘤研究中表明TGF-β信号传导通路超家族的各个生物学机制需要下游复杂的信号传导过程,也需要各个基因、分子之间的协同作用,因此研究下游信号通路的改变和相互作用,能够更准确地了解肿瘤的发生发展机制。实体瘤组织内普遍存在低氧的情况,肿瘤因过度生长导致其血管供血和供氧能力相对不足而产生缺氧状态,然而恶性肿瘤在生长过程中,可以通过自身的调节增加新生血管,扩张血管,提高细胞糖酵解,克服低氧和营养不足的情况继续生长,因此肿瘤的生长、增殖和转移必然和其能够通过一系列细胞因子复杂的作用,克服缺氧的状态和环境有关。Wilms Tumor的肿瘤位于腹膜后,位置较为隐匿,早期没有特异性的症状和体征,生长较为迅速,发现时往往比较大,直径常常大于10cm,较多病例的肿瘤组织表现为囊性和实性相间,内部有明显缺氧液化的情况,并且部分出现坏死灶,肿瘤内部明显存在缺氧微环境。近年来国内外开始对HIF-1α在Wilms Tumor中的作用机制进行初步的研究。结果表明HIF-1α在Wilms Tumor组织中表达明显增高,可能是Wilms Tumor的正向调节因子,并且与临床分期和预后有密切的相关性,对指导临床治疗和判断预后有一定帮助。Wilms Tumor组织中HIF-1α可能会刺激血管上皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达,保证肿瘤内部的血液供应,这也可能是以后治疗的一个靶点。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)在Wilms Tumor中是目前发现的介导细胞低氧反应中关键的转录因子之一。HIF-1α是在缺氧条件下传递缺氧的信号、介导缺氧效应的重要转录因子,通过结合缺氧反应因子激活下游众多靶基因从而参与肿瘤侵袭、转移、血管生成、能量代谢以及放化疗抵抗等多个环节。上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)的发生是在胚胎发育、肿瘤细胞侵袭和转移过程中起到关键作用的机制。而HIF-1α在肿瘤低氧微环境中通过介导的低氧信号传导作用启动和EMT的发生,多种机制参与其中,已知的相关信号通路有Notch信号通路、Wnt信号通路、干细胞生长因子/干细胞生长因子受体信号通路(HGF/Met)和刺猬信号通路。但是在Wilms Tumor中的HIF-1α具体的调控机制如何仍然不甚清楚,是否参与到’Wilms Tumor细胞的侵袭性和转移能力增加也不清楚。二、研究目的本研究的目的是通过收集Wilms Tumor病人的临床病理资料、病理组织标本和随访情况,采用分子生物学的方法检测病人肾母细胞瘤标本TGF-β信号通路超家族中84个重要基因中的突变差异情况,并且进行筛选和验证,最后与临床病理学指标进行相关性的分析,以期建立更加精确诊断、预测肾母细胞瘤病人预后情况的方法。另外利用SK-NEP-1人肾母细胞瘤细胞株在低氧环境中培养,模拟建立体外低氧环境下肿瘤细胞培养的模型,对比正常氧浓度环境下的结果,分析SK-NEP-1人肾母细胞瘤细胞的形态变化、生长情况。检测HIF-1α表达量,用以说明SK-NEP-1人肾母细胞瘤细胞在两种环境中表达水平的变化。另外检测SK-NEP-1人肾母细胞瘤细胞中上皮细胞的标志性蛋白,即上皮钙粘蛋白(E-cadherin),间质细胞的标志性蛋白,即波形蛋白(Vimentin)的表达量,从而分析HIF-la在Wilms Tumor中是否通过EMT转化的作用机制增加肿瘤侵袭性和迁移能力。最后推测我们进一步治疗可能的靶点和逆转途径。三、材料与方法1、临床WT组织标本的收集、分组本研究通过广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准,可以进行本实验。收集本中心治疗的,2010年1月至2012年12月符合单侧Wilms Tumor病理诊断的临床病例28例。所有术前化疗及双侧Wilms Tumor的病例均排除在本实验之外。手术中分别取了28例病人瘤体标本作为肿瘤组(28例)和癌旁肾组织作为癌旁组(28例)。2、临床肿瘤标本组织处理及RNA的提取和检测Wilms Tumor肿瘤组织作为肿瘤组,癌旁肾组织作为癌旁组,分别提取总的RNA。用核酸蛋白定量仪(NanoDrop 2000/2000 ultra-micro uv-vis分光光度计)检测OD260/OD280,判断提取RNA的浓度；为了排除RNA有降解或基因组DNA有污染,取溶解好的RNA溶液置于1%的琼脂糖凝胶上电泳检测,以RIN (RNA Integrity Number)的值、28S和18S的比例及条带清晰程度,用以观察样品总RNA的纯度和完整性。3、TGF-β/BMP信号通路突变的差异基因的初步筛查随机抽取前述Wilms Tumor肿瘤的Ⅰ期、Ⅱ期组织标本各1例,Ⅲ期组织标本2例,予以混合RNA,用于初步筛查,利用Human TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array标准试剂盒检测信号通路84个基因的突变差异情况。4、利用RT-PCR的方法在28例组织标本上验证TGF-β信号通路超家族中突变明显的差异基因根据Human TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array初筛的检测结果,分析和筛选可能突变的差异基因,提示84个基因中出现7个肿瘤组相较癌旁组增加10倍以上的差异突变基因,分别是AMH(12倍)、BMPR1A(27倍)、CHRD (43倍)、COL1A2(10倍)、GDF2(27倍)、IGF(14倍)、NROB1(11倍)。考虑TGF-β信号传导通路超家族突变差异基因可能存在于这7个基因里,利用RT-PCR方法在全部28个病例的肿瘤组和癌旁组的标本中进行检测验证。5、Wilms Tumor组织TGF-β信号通路超家族突变差异基因与临床病理因素的相关性分析本研究临床病理的各项因素,包括性别、年龄、分期、病理分型和侵袭／远处转移,随访时间3至5年,患者有无复发,这些指标与BMPR1A mRNA表达是否升高进行比较。差异表达基因表达量与临床病理因素的比较采用Chi-Square检验。P<0.05被认为差异有统计学意义。6、SK-NEP-1人肾母细胞瘤在不同氧浓度下细胞培养的形态学评估SK-NEP-1人肾母细胞瘤细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞库)在两种氧浓度下培养。实验组,即缺氧诱导组20份,将培养液氧浓度调整至1%,37摄氏度条件下培养6小时。对照组,即正常组20份,为正常氧浓度21%,37摄氏度条件下培养6小时。分别在显微镜下观察肿瘤细胞生长的形态。7、正常组及缺氧诱导组肿瘤细胞RNA的提取和RT-PCR方法的检测HIF-1α的mRNA量8、Transwell侵袭性实验和Transwell迁移性实验将正常组及缺氧诱导组两组培养细胞置入Transwell板中,分别进行侵袭性实验和迁移性实验,染色胶膜上的肿瘤细胞,并在倒置显微镜下计数肿瘤细胞进行配对的T检验,比较统计学差异。9、利用Western blotting方法检测正常组及缺氧诱导组中人Wilms Tumor SK-NEP-1细胞的HIF-1α、Vimentin、E-cadherin以及B-actin蛋白表达量四、研究结果1、TGF-β信号传导通路超家族差异基因的筛选和验证对临床Wilms Tumor组织标本提取的总RNA数量、质量及完整性进行检测,结果符合进一步实验的标准。Human TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array标准试剂盒检测TGF-β信号传导通路超家族中84个基因的突变差异情况,初步筛选出7个肿瘤组与癌旁组比较,mRNA表达量大于10倍的可能的突变差异基因,分别是AMH(抗苗勒氏管激素)(12.07倍)、BMPR1A(骨形态生成蛋白1A型受体)(27.15倍)、CHRD(腱蛋白)(43.40倍)、COL1A2(I型胶原)(10.45倍)、GDF2(生长分化因子2)(27.84倍)、IGF(胰岛素样生长因子1)(14.54倍)、NROB1(核受体家族)(11.18倍)。RT-PCR方法在28例Wilms Tumor病人的肿瘤组织和癌旁肾组织中验证的结果是BMPR1A(p=0.036<0.05)和NROB1(p=0.039<0.05)是突变的差异基因。2、BMPR1A基因表达与Wilms Tumor病人临床病理资料的相关性分析BMPR1A基因的表达在临床病理资料各因素内(性别、年龄、分期、侵袭和转移、复发、病理类型)比较,P均大于0.05,各组内没有明显差异。3, SK-NEP-1人肾母细胞瘤在不同氧浓度下细胞培养的形态学评估在正常组中,肿瘤细胞显示多边形,排列规则紧密。在低氧诱导组中,肿瘤细胞显示椭圆形或纺锤形,排列松散且不规则。4、缺氧诱导组及正常组人Wilms Tumor SK-NEP-1细胞HIF-1α mRNA水平的比较对SK-NEP-1人肾母细胞瘤细胞株培养的正常组及缺氧诱导组中分别提取RNA数量、质量及完整性进行检测,结果显示符合进一步实验的标准。RT-PCR检测结果显示缺氧诱导组(6.36±0.76)中HIF-1α mRNA表达水平明显上升,并且显著高于正常组(2.69±0.86)(p<0.05)。5、缺氧诱导组及正常组上皮细胞-间充质细胞转化相关蛋白水平表达的比较利用Western blotting方法分别检测]HIF-1α、Vimentin、E-cadherin及Actin蛋白的表达,结果显示HIF-1α和Vimentin的蛋白水平在缺氧诱导组中明显上升并高于正常组(0.96±0.15 vs 0.51±0.06；1.01±0.13 Vs 0.81±0.06,p<0.05),而E-cadherin的蛋白水平在缺氧诱导组中下降并明显低于正常组(1.03±0.13 vs 1.15±0.11,p<0.05)。6、缺氧诱导组和正常组SK-NEP-1人Wilms Tumor细胞侵袭性和迁移性能力利用Transwell迁移实验和侵袭性实验方法检测结果：两组WT细胞数目检测结果发现两种胶膜中肿瘤细胞数在缺氧诱导组中显著高于正常组。(P<0.05)五、讨论1、利用PCR芯片的方法在临床肾母细胞瘤肿瘤组织标本中筛选出TGF-β信号传导通路超家族中突变差异基因为BMPR1A和NROB1TGF-p/BMP信号传导通路PCR芯片检测并在大样本中验证出突变差异基因为BMPR1A和NROB1。BMPR1A(骨形态生成蛋白1A型受体)基因位于人染色体10q23,又称ALK3。它在TGF-β信号传导通路超家族中属于TGF-β细胞因子超家族受体的类别。文献证实在乳腺肿瘤中,BMPR1A的缺乏不仅影响肿瘤细胞增殖的启动,而且会影响肿瘤细胞的上皮间质转化作用,其高表达会明显增加乳腺癌的侵袭性。利用小鼠敲除BMPR1A模型能够证实干预BMP的受体能够给治疗高分期的神经胶质瘤更好的帮助。miR-656能够抑制神经胶质瘤的生长和进展,是通过抑制BMPR1A的表达。而在本研究中,BMPR1A基因mRNA在WT肿瘤组织中明显升高,可以说明其在Wilms Tumor的发生和进展中起到了重要作用,进而影响了TGF-β信号传导通路超家族在肿瘤中的作用,可能促进了肿瘤的生长、侵袭和转移。但是具体的的影响机制不明确,是否对其进行干预能够延缓肿瘤的生长等还有待进一步的体外和体内实验证实。NROB1目前与肿瘤的相关研究较少,拟进一步明确表达的临床相关性后再对NROB1的表达升高与Wilms Tumor关系进行讨论。2、TGF-β/BMP信号传导通路超家族突变差异基因BMPR1A表达的增加与临床病理特点的相关分析暂时无明显意义,需要进一步增加病例数后明确相关关系我们对病人的术前信息、术后肿瘤的分期、侵袭和转移(淋巴结、输尿管、肾盂、肾内和肾外血管)、复发和病理类型(预后良好型和预后差型),分别和BMPR1A mRNA的检测量进行统计学相关分析的比较。结果显示BMPR1A mRNA升高在这些临床因素中没有明显统计学差异。这可能与本次研究的病例数不足有关,应该联合多家中心,扩大病例数。增加比较的因素,如存活率和无瘤存活率等,可能可以找到有价值的临床意义。3、缺氧诱导条件下肾母细胞瘤肿瘤SK-NEP-1细胞生长的模型是研究HIF-1α的一个很好的体外模型4、HIF-1α在人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞缺氧诱导模型中是通过介导上皮间质转化的作用机制,在肿瘤的侵袭和转移中起到重要作用缺氧微环境能够上调人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞表达HIF-1α,促进了该肿瘤细胞的形态转变,提高了其组织侵袭性和迁移性的能力。Vimentin蛋白表达的上调和E-cadherin蛋白的下调也提示肿瘤细胞的EMT能够促进其转移。如果能够通过阻断HIF-1α下游信号通路的传导来改善肿瘤微环境,这样可能是一个有效抑制肿瘤侵袭和远处转移的方案。尽管这需要明确更多的机制和进一步的研究,但是这能够给我们控制肿瘤的快速生长和转移提供了思路,给一些临床病人的手术治疗带来更多的希望。六、结论1、肾母细胞瘤中TGF-p信号传导通路超家族中突变差异基因为BMPR1A和NROB1。BMPR1A表达的增加暂时未发现与临床病理学因素有相关性,需要进一步增加病例数验证。2、缺氧诱导条件下建立肾母细胞瘤肿瘤SK-NEP-1细胞生长的模型是研究HIF-1α的一个很好的体外模型。3、HFI-1α在人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞缺氧诱导模型中是通过介导上皮间质转化的作用机制,在肿瘤的侵袭和转移中起到重要作用。