喉癌,是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高、死亡率高、生存预后差。目前现代医学对喉癌患者主要以局部手术治疗、放疗及全身化疗等,治疗费用高;而且手术患者术后存在发音问题,术后痰多、拔管难也给很多患者带来烦恼,放、化疗在杀死癌细胞的同时,也杀死正常细胞,放、化疗后的并发症长期影响患者身心健康。近年的研究提示,中医辨证要素“痰”、“瘀”与恶性肿瘤具有相关关系;前期初步研究也表明,“痰”、“瘀”与喉癌前病变存在相关关系。“痰”、“瘀”与喉癌是否相关,喉癌的中医治疗是否能从“痰”“瘀”着手打开突破口,值得进一步研究。研究目的:本研究采用回顾性病例分析的方法,分析近12年来喉癌的中医证侯辨证要素分布规律及中医证型,并根据回顾性分析结果,通过以方测证的方法探讨活血化痰法对喉癌动物模型的作用及选取标本进行高通量测序检测miRNA的表达,希望能对上述问题作初步的探讨,为今后痰瘀与喉癌关系的深入研究打下基础,并为从RNA水平寻求中医药治疗靶点提供研究点。研究方法:一、临床研究回顾性收集2003年1月1日至2014年12月31日在广东省中医院耳鼻喉科住院部诊治的、病理诊断明确、有详细诊疗记录,未进行放化疗、手术等治疗的喉鳞状细胞癌的患者,通过制定《喉癌患者信息采集表》采集患者的一般资料、临床症状、舌脉信息、入院检查结果、既往史、个人史等相关情况,并对所有患者进行随访,记录随访结果。将上述数据输入EpiData3.1软件,转换为Excel格式进行检查核对、查缺纠错等预处理后,导入SPSS17.0统计软件,首先采用描述性分析统计所有关于喉癌患者的症状、舌、脉等的频数,删除频数小于10%的症状。然后对纳入的症状、舌、脉变量全部进行量化处理,按出现、不出现分别记为1、0分,另外建库导入SPSS17.0对纳入的症状进行相关性分析、因子分析、指标聚类分析,并对151例喉癌患者进行中医证侯样本聚类分析。二、实验研究本研究根据回顾性研究的结果及痰瘀致肿瘤理论,观察活血法、化痰法及活血化痰法对喉癌动物模型成瘤过程的作用,比较上述3种方法对喉癌动物模型瘤体体积、密度、瘤重的影响与对照组的差异,并选取标本进行高通量测序。研究结果:一、临床研究(一)对症状的频数分析表明:①喉癌患者的主诉以声嘶为多见(121例,80.1%),之后依次是呼吸困难、颈肿物、咽痛、咽异物感,出现的频率均较少,均在10%以内。②喉癌患者的症状出现频数最高的仍然是声嘶(138例,91.4%),出现频率在20%以上的还有咽异物感、咳嗽、咽干、咽痛这四种,另外还有吞咽不顺、咽痒、呼吸困难、颈肿物、咽灼热感这5种症状,但是出现的次数较少,频数均在10%以下。③喉癌患者的舌象出现频数最多的是舌暗或有瘀点(109例,72.2%),还有其他出现较多的舌象按频数从高到低排列依次是舌红、苔黄腻、舌淡红、苔白腻、苔薄白,出现的频数均大于10%。④喉癌患者的脉象出现频数最多的是脉滑(120例,79.5%),其他出现频数较多的脉象为脉弦(75例,49.7%)、脉细(20例,13.2%),出现频数在10%以上。(二)对症状的相关性分析表明,①喉癌出现频数最多的症状“声嘶”与咽痛、舌红呈负相关关系(P<0.05);②症状咽异物感、咳嗽、咽干、咽痛与其他舌脉症状均不相关(P>0.05)。③该组患者的舌、脉要素分别体现中医要素痰湿、湿热、瘀、虚4个要素。(三)对症状的因子分析表明,该组症状可提取6个公因子,这6个公因子的累积总贡献率为68.6%。根据各公因子的相关定义,可将6个公因子归纳为4类,反映3种中医证侯要素,即:湿热、瘀、虚。(四)对症状的聚类分析表明,该组症状要素可聚为3类:第一类为咽痛,舌淡红,苔薄白/苔白腻,脉细,此类证侯群中医可辨为痰湿证、虚证;第二类为声嘶,舌暗或有瘀点,脉滑,此类证侯群中医可辨为痰瘀互结证;第三类为咽干,咽异物感,咳嗽,舌红,苔黄腻,脉弦,此类证侯群中医可辨为湿热证。(五)对151例喉癌患者的样本聚类表明,该组患者的中医证型聚为3类较好,即痰湿夹瘀证、痰热瘀互结证、血瘀证,并且在喉癌患者中,痰热瘀互结证所占的比例最多,占总数的52.3%。(六)分析聚类结果所得中医证型,在不同的发病时间、T分期、不同的发病年龄段、性别、预后、主诉中的分布差异性,结果均无统计学意义(P>0.05)。但是从分布趋势来看中医证型分布,痰瘀互结症在发病到确诊时间小于半年的患者中所占比例高于发病到确诊时间大于半年的患者中所占比例;在T临床分型中中医证型的分布也有这样的趋势,T分型为T1-2的患者中痰瘀互结症所占的比例高于T3-4的患者。二、实验研究(一)本研究通过动物实验,比较活血法、化痰法及活血化痰法对喉癌动物模型的作用,结果发现:①从生长曲线图可知,化痰法治疗组的瘤体生长曲线较活血法、活血化痰法及对照组低矮,且走势平缓。②对各组瘤体每周体积测量结果比较得知,化痰组第一、二、四周的瘤体体积与对照组比较差异显著,有统计学意义(P<0.05)。而活血组及活血化痰组在各周所测的瘤体体积与对照组比较,差异多无统计学意义(P>0.05)。③对各组动物取瘤后瘤体体积、瘤重、密度的比较得知,各治疗组体积、瘤重、密度与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而对数据进行余弦函数转换后,活血组的瘤重与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),体积和密度比较,差异仍无统计学意义(P0.05),而化痰组及活血化痰组的瘤重、体积、密度与对照组比较,差异仍无统计学意义(P>0.05)。(二)测序结果表明:①活血法、化痰法及活血化痰法均可导致已知抑癌基因miR-451a表达上调,且3个治疗组分别与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。②化痰法可使可疑是抑癌基因的miR-19a-3p表达水平较对照组显著上调,而活血法组及活血化痰法组中该miRNA的表达水平与对照组比较无差异(P>0.05);活血化痰法可使可疑是抑癌基因的miR-378a-3p的表达水平与对照组比较呈显著上调,而化痰组与活血组中该miRNA的表达水平与对照组比较无差异(P>0.05)。③化痰法可使可疑是肿瘤 miRNA 的 miR-199a-5p、miR-99b-5p、miR-183-5p、miR-148a-5p 表达与对照组比较有显著下调作用,可能是化痰法治疗的靶点;活血化痰法对可疑是肿瘤miRNA的miRNAmiR-96-5p的表达有显著下调作用,可能是活血化痰法治疗的靶点。结论:一、临床研究(一)喉癌患者出现最多的主诉症状是声嘶。(二)喉癌与中医要素“痰”、“瘀”、“热”具有相关关系,而且在喉癌的早期多与中医要素“痰”“瘀”相关,瘀互结证可能是喉癌患者的基本中医证型。(三)喉癌的中医证型发展规律为:以中医要素“痰瘀”为主导,并随着发病时间的推移、肿瘤的侵犯而逐步演变的过程。二、实验研究(一)动物实验活血法和化痰法在hep-2细胞增殖喉癌形成的早期,可能起到抑制肿瘤生长的作用,可能因药物剂量的不足及作用时间的不足,在瘤体宏观指标如体积、密度、瘤重等方面体现不充分。(二)miRNA检测结合各组瘤体体积的生长曲线图、各治疗组离体的瘤体体积、密度、瘤重与对照组的比较差异及高通量测序的结果,本研究认为活血法、化痰法、活血化痰法对喉癌可能均可起到治疗作用,支持化痰法对喉癌起到治疗作用的证据较充分。