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目的收集并纯化间充质干细胞来源的微颗粒(MSC-MPs),观察其对过氧化氢(H2O2)诱导H9C2心肌细胞损伤的保护作用,并初步研究其机制。方法使用全骨髓贴壁法分离纯化MSCs,运用显微镜观察细胞形态学变化、流式细胞术鉴定表面抗原、细胞计数法绘制细胞生长曲线以及诱导MSCs成骨和成脂分化四种方法来对MSCs进行鉴定。使用无血清培养基处理第5代MSCs 48 h,收集上清液后梯度离心获取MSCMPs。利用BCA法检测MSC-MPs的蛋白含量,利用流式细胞术检测MSC-MPs的大小、数量和表面抗原。使用80μmol·L-1的H2O2处理细胞3 h,诱导H9C2细胞氧化应激损伤模型,研究24和48μg·ml-1的MSC-MPs预处理H9C2心肌细胞24 h以后,其对细胞存活率、细胞释放的乳酸脱氢酶等指标的影响,包括:使用CCK-8法检测细胞存活率,使用检测试剂盒分别检测细胞中的MDA、SOD、GSH-Px以及细胞LDH释放量,运用JC-1检测试剂盒和ROS检测试剂盒检测ROS相对含量和线粒体膜电位水平,使用Caspase-3检测试剂盒和Caspase-9检测试剂盒检测细胞中Caspase-3和Caspase-9的含量,使用实时荧光定量PCR检测细胞中的PTEN、Bcl-2和Bax的表达情况。实验共分为5组:(1)对照组(Control):加入培养基和与实验组等体积PBS;(2)心肌细胞损伤组(H2O2):加入含80μmol·L-1过氧化氢的培养基;(3)MPs(24μg·ml-1)组:使用含24μg·ml-1的MSC-MPs预处理H9C2细胞24 h,然后加入含80μmol·L-1过氧化氢的培养基;(4)MPs(48μg·ml-1)组:使用含48μg·ml-1的MSC-MPs预处理H9C2细胞24 h,然后加入含80μmol·L-1过氧化氢的培养基。(5)上清液组(Supernatant):使用含等体积上清液的培养基预处理H9C2细胞24 h,然后加入含80μmol·L-1过氧化氢的培养基。结果1.实验成功分离了大鼠MSCs,第5代MSCs在光镜下呈梭形和典型的“鱼群样”分布;细胞的增殖能力较强;通过流式细胞术鉴定其表面抗原,其中CD90和CD29的阳性率分别为(99.81±0.94)%和(99.90±0.66)%,CD45和CD34的阳性率分别为(0.89±0.31)%和(1.79±0.33)%;大鼠MSCs成骨和成脂诱导分化均呈阳性。2.使用梯度离心法分离MSC-MPs,流式细胞术检测MSC-MPs数量,结果表明,MSC-MPs浓度为(2.55±0.86)×107个/ml;通过流式细胞术检测MSC-MPs表面抗原,实验结果表明CD90和CD29的阳性率分别为(97.46±1.85)%和(94.00±2.03)%,CD45和CD34的阳性率分别为(4.89±1.05)%和(1.81±0.33)%,MSC-MPs表面标记物与MSCs相似。3.使用不同浓度的H2O2作用于H9C2细胞3 h,CCK-8实验结果表明,随着H2O2的浓度不断升高,细胞活力逐渐下降(P<0.05),当H2O2浓度为80μmol·L-1时,细胞存活率为(46.12±4.68)%(P<0.05),接近50%,故选取此浓度为造模浓度。4.CCK-8法检测MSC-MPs预处理对H9C2心肌细胞氧化应激损伤后细胞存活率的影响,实验结果表明MSC-MPs(24μg·ml-1、48μg·ml-1)可以将细胞存活率从损伤模型组的(46.12±4.68)%提高至(53.69±3.06)%和(73.30±4.84)%(P<0.05),而Supernatant组H9C2心肌细胞存活率无明显变化。5.试剂盒检测H9C2上清液内LDH和细胞内SOD、MDA和GSH-Px的含量,实验结果表明,与H2O2组相比,MSC-MPs(24μg·ml-1、48μg·ml-1)预处理可以使细胞内的MDA含量从(1.98±0.11)mmol·mg-1分别下降至(0.97±0.06)mmol·mg-1和(0.86±0.12)mmol·mg-1(P<0.05),使上清中的LDH含量由(343.89±11.43)U·L-1分别下降至(288.39±15.99)U·L-1和(266.27±12.93)U·L-1(P<0.05),而使细胞内的SOD从(184.78±20.88)U·mg-1分别上升至(259.27±27.90)U·mg-1和(334.88±31.24)U·mg-1(P<0.05),使细胞内的GSHPx从(139.09±9.22)U·mg-1上升至(170.48±13.83)U·mg-1和(177.21±16.51)U·mg-1(P<0.05);Supernatant组的LDH、MDA、SOD和GSH-Px与H2O2组相比均无明显变化。6.MSC-MPs(24μg·ml-1、48μg·ml-1)预处理可以降低H9C2心肌细胞内的ROS水平。实验结果表明,相对于H2O2组,MSC-MPs预处理可以使细胞内荧光强度显著降低,而Supernatant组的荧光强度无明显变化。7.MSC-MPs(24μg·ml-1、48μg·ml-1)预处理可以降低线粒体的损伤程度,通过JC-1荧光实验可以表明,与H2O2组相比,MSC-MPs(24μg·ml-1、48μg·ml-1)预处理可以使Red/Green荧光强度比值显著上升,而Supernatant组的Red/Green荧光强度比值无明显变化。8.通过比色法检测H9C2细胞内Caspase-3和Caspase-9活性,实验结果表明,H2O2组Caspase-3和Caspase-9水平分别为(151.76±8.97)U·mg-1和(205.83±10.48)U·mg-1,MSC-MPs(48μg·ml-1)预处理可以显著降低Caspase-3和Caspase-9水平至(118.28±8.67)U·mg-1和(174.42±12.17)U·mg-1(P<0.05),而Supernatant组的Caspase-3和Caspase-9水平均无明显变化。9.实时荧光定量PCR的实验结果表明,与H2O2组相比,MSC-MPs(48μg·ml-1)预处理可以使显著降低H9C2心肌细胞内的Bax和PTEN表达水平,显著升高Bcl-2的表达水平,而Supernatant组的PTEN、Bcl-2和Bax水平均无明显变化。结论1.使用全骨髓贴壁法成功分离并纯化了大鼠骨髓间充质干细胞,并在此基础上使用梯度离心法分离了MSC-MPs;2.使用24和48μg·ml-1的MSC-MPs对H9C2细胞进行预处理,可以减轻H2O2对H9C2心肌细胞的损伤作用,提高细胞存活率,初步证实其保护作用和MSC-MPs抑制PTEN的表达、降低细胞内ROS水平从而抑制线粒体凋亡通路的激活有关。