TcLr35小麦中NBS类抗病基因同源序列的分离及鉴定

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小麦叶锈病是我国小麦生产中的主要病害之一,选育抗病品种是防治小麦叶锈病最经济有效的途径。发掘抗叶锈病相关基因及其紧密连锁的分子标记,是进行基因聚合、基因布局和多系品种选育的关键。本研究利用NBS profiling技术和抗病基因同源序列(RGA)法在TcLr35等小麦抗叶锈病近等基因系材料中分离NBS-LRR类抗病基因同源序列。主要研究内容包括以下几个方面:1.以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr35和感病亲本Thatcher为材料,分别在基因组DNA和cDNA中成功构建了NBS profiling体系。2.选取15个回交6代小麦抗叶锈病近等基因系(NILs)及其感病亲本Thatcher基因组DNA为模板,4种限制性内切酶(AluⅠ、HaeⅢ、MseⅠ、RsaⅠ)和4种简并引物(NBS2、NBS3、NBS5、NBS7)共16种酶/引物组合,利用NBS profiling技术进行DNA指纹图谱分析。结果表明:MseⅠ/NBS2、MseⅠ/NBS5、MseⅠ/NBS7均得到了较好扩增结果,多态性检出率分别为26.4%、26.4%、23.5%;AluⅠ/NBS3、HaeⅢ/NBS3、MseⅠ/NBS3、RsaⅠ/NBS3扩增背景一致,在检测材料间未表现多态性。3.选取4种限制性内切酶(AluⅠ、HaeⅢ、MseⅠ、RsaⅠ)和13种简并引物(S1、S2、Ploop4、NBS2、NBS3、NBS5、NBS5a、NBS6、NBS7、NBS9、KIN1、KIN5、GLPL4)共52对酶/引物组合,分别在TcLr35和感病亲本Thatcher基因组DNA和cDNA中筛选差异片段,最终在TcLr35中获得6条特异性条带。4.利用抗病基因同源序列(RGA)法和电子克隆在TcLr35小麦中获得了一条通读的抗病同源基因,该基因长1419bp,包含1323bp ORF区,编码440个氨基酸,含有NB-ARC保守结构域和两个典型的LRR保守结构域,暂命名为TcLr35-S11A11。系统进化树分析表明,其编码蛋白和大麦、燕麦中的NBS-LRR类抗性蛋白亲缘关系较近。利用半定量RT-PCR技术分析,结果表明在取样范围内,TcLr35-S11A11基因的表达不受叶锈菌的诱导,属于低丰度组成型表达,与大多数此类基因表达模式类似。
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