研究背景与目的:胆固醇对于维持细胞正常的生理功能有着重要的意义。随着人类生活方式及饮食结构的改变,高胆固醇血症患者急剧增多。大量研究表明,高胆固醇血症是许多严重疾病的危险因素,包括动脉粥样硬化,冠心病及脑卒中等。但是,胆固醇与恶性肿瘤之间的关系一直备受争议。在一些流行病学研究中,血液总胆固醇水平与肝癌、食管癌、肺癌、胃癌等的发病呈明显的负相关,而与膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌等的发病呈正相关,而且相关关系会受性别和人种等差异的影响。这些结果表明胆固醇在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,且在不同类型的肿瘤中具有不同的作用模式,但其分子机制一直未被阐述清楚。因此,深入研究高胆固醇血症对肿瘤的影响并明确相关分子机制,对于肿瘤的预防和治疗均具有重要意义。实验方法及步骤:1.利用循证医学方法研究血胆固醇水平与多种肿瘤发生风险的关系检索收集已发表文献,提取数据进行循证医学统计和分析,明确胆固醇代谢异常对总肿瘤、肝癌、肺癌发病率的影响,为本项目的研究题目提供可靠的现实依据。2.构建饮食诱导及基因型诱导小鼠高胆固醇血症模型高胆固醇饮食诱导:给予6-8周龄野生型C57小鼠高胆固醇饮食4周,诱导小鼠产生高胆固醇血症。Apo E基因缺失小鼠:C57遗传背景下的Apo E-/-小鼠会自发产生高胆固醇血症。被广泛用于动脉粥样硬化相关研究,本研究采用6-8周龄Apo E-/-小鼠进行后续实验。3.在高胆固醇血症小鼠模型基础上,构建小鼠荷瘤、诱癌以及肿瘤转移模型荷瘤模型:采用皮下荷瘤的方法,观察黑色素瘤、肝癌、肺癌、前列腺癌细胞在高胆固醇血症小鼠模型中的生长情况。诱癌模型:通过给予出生15天小鼠腹腔DEN注射(25mg/kg)诱发肝癌形成,观察高胆固醇血症小鼠的肝癌发生发展情况。通过支气管灌注Cre病毒的方法,诱发KrasG12D小鼠肺部特异性的Kras突变激活,诱发小鼠肺癌,观察小鼠高胆固醇血症对肺癌发生发展的影响。黑色素瘤肺转移模型:经小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞,构建小鼠黑色素瘤肺转移模型,观察小鼠高胆固醇血症对黑色素瘤肺转移的影响。4.通过转录组测序等方法探寻高胆固醇影响肿瘤发生发展的途径收集对照组及高胆固醇组的小鼠荷瘤组织,进行转录组测序分析,并对差异基因进行KEGG及GSEA分析,探索相关的基因及信号通路改变。5.检测高胆固醇对免疫细胞的影响,明确发挥作用的关键免疫细胞亚群利用PCR及流式检测方法检测荷瘤组织中免疫细胞的相对比例,观察自然杀伤细胞(NK)、CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NKT细胞及DC细胞的相对比例和绝对数变化。利用相应清除性抗体清除各类免疫细胞,观察对照小鼠及高胆固醇小鼠的肿瘤生长差异,明确发挥作用的免疫细胞亚群。6.检测高胆固醇对于关键免疫细胞功能以及杀伤能力的影响利用PCR及流式检测方法,分析高胆固醇组免疫细胞的活性,并通过细胞毒性实验、脱颗粒实验及细胞过继实验,证明高胆固醇组来源的免疫细胞在体内外,均具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力。检测对照组及高胆固醇组免疫细胞胆固醇含量的变化,并通过体外人为调节免疫细胞胆固醇水平,调节其杀伤肿瘤细胞的能力。7.探索高胆固醇影响关键免疫细胞功能的分子机制检测对照组及高胆固醇组免疫细胞中免疫受体数量、定位的变化,相关通路的活化情况,明确高胆固醇调控免疫细胞功能的关键通路与分子事件。8.探索通过调节胆固醇代谢改善免疫细胞抗肿瘤活性的方式方法利用慢病毒过表达低密度脂蛋白受体(LDLR)或PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,检测这些方法对免疫细胞内胆固醇含量及其肿瘤杀伤能力的影响。研究结果:首先,我们通过荟萃分析(Meta),发现人群恶性肿瘤总体发病率,以及肝癌、肺癌的发生率与血总胆固醇水平呈明显的负相关。在高胆固醇组小鼠体内,多种肿瘤的发生、生长及转移受到抑制。转录组测序分析证明,对照组与高胆固醇组的差异基因在免疫系统及免疫细胞活化相关通路有着明显富集。同时,高胆固醇血症对肿瘤的抑制现象在NSG小鼠中不复存在,这表明此抑制作用可能和免疫系统密切相关。随后,我们发现在高胆固醇小鼠的肿瘤组织中NK细胞比例明显上调,而其他免疫细胞的比例则没有显著变化。NK细胞清除性抗体或清除剂可以消除高胆固醇对肿瘤生长的抑制作用,这表明高胆固醇主要通过NK细胞发挥抗肿瘤作用。随后,我们检测发现高胆固醇组小鼠体内NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力明显增强,细胞内总胆固醇含量及膜胆固醇含量明显上升。在体外,以胆固醇处理正常NK细胞可增强其细胞毒性,而用环糊精降低细胞胆固醇含量可下调高胆固醇组NK细胞肿瘤杀伤能力。在机制方面,我们发现细胞内胆固醇蓄积会增加细胞表面的脂筏数量,使NK细胞的激活性受体NCR1及NKG2D在脂筏定位增多,下游的信号通路激活,从而上调了NK细胞的活化能力。最后,我们证实过表达LDLR,或通过PCSK9抗体抑制免疫细胞表面LDLR的降解,均可以增加NK细胞的胆固醇含量,进而增强其抗肿瘤活性。研究结论:血液中的胆固醇水平对免疫细胞的抗肿瘤作用具有重大影响。NK细胞内胆固醇蓄积可增加细胞膜表面的脂筏数量,促进激活性受体向脂筏的移位,进而激活下游信号通路,增强其肿瘤杀伤能力。目前,肿瘤的免疫治疗正在快速发展。我们的研究表明升高免疫细胞内胆固醇水平,可增强其杀伤功能,改善其抗肿瘤作用,为肿瘤的免疫治疗提供了新思路与新策略。