论文部分内容阅读
Kex2蛋白酶是一种来源于酵母的前体加工蛋白酶,能识别并切割碱性氨基酸残基对中的羧基端肽键,在酵母的蛋白分泌途径中起关键作用,并且在真核细胞蛋白的研究中也应用广泛。目前多用毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）来表达Kex2蛋白酶,但有关毕赤酵母Kex2蛋白酶（PPKex2）的同源活性表达与酶学性质的研究还鲜有报道,并且Kex2蛋白酶较低的表达量导致其生产成本过高,不利于大规模的应用。本课题利用毕赤酵母表达系统对PPKex2进行了同源表达,并研究其酶学性质,同时与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）Kex2蛋白酶（SCKex2）进行了比较。并采用高密度扩大发酵、截短C端序列、更换启动子和伴侣蛋白共表达等方式提高PPKex2的表达量。主要研究成果如下所述:（1）分别从毕赤酵母和酿酒酵母基因组中获得kex2基因,将其插入到表达载体pPIC9K中,并转化毕赤酵母GS115菌株。重组菌株经甲醇诱导表达后,结果表明PPKex2的蛋白浓度达到0.42 mg·mL-1,酶活达到30.2 U·L-1,PPKex2的发酵上清比酶活是SCKex2的7倍。Kex2蛋白酶使用Q-FF强阴离子交换柱进行纯化并研究酶学性质。结果表明,PPKex2的最适反应pH是8.0-9.0,最适反应温度是37oC,与SCKex2性质相近。在稳定性方面,PPKex2在pH 7.0时最稳定,在碱性条件下的稳定性高于SCKex2,在酸性条件下的稳定性低于SCKex2,另外PPKex2的温度稳定性略低于SCKex2。酶促反应动力学研究表明,PPKex2的kcat和kcat/Km值分别为SCKex2的4.8倍和3.3倍。（2）PPKex2表达菌株高密度扩大发酵结果表明,在3 L发酵罐中,PPKex2表达菌株发酵上清中蛋白浓度最高达到0.88 mg·mL-1,是摇瓶水平的两倍;PPKex2最高酶活达到38.6 U·L-1,比摇瓶水平提高了20%。为提高PPKex2表达量,进行了添加辅助表达物的发酵优化。结果表明,在甲醇诱导阶段流加质量比为30:1的甲醇-山梨醇混合碳源,PPKex2表达量提高了16%;在甲醇诱导阶段补加1%（w/v）的酪蛋白氨基酸,PPKex2表达量提高了9%。（3）研究FDH1、FLD1、DAS1、DAS2、THI4、THI11、HSP82、GAP八种启动子对PPKex2表达的影响。结果表明,FDH1启动子的PPKex2表达量最高,发酵上清中蛋白浓度和PPKex2酶活分别达到1.03 mg·mL-1和61.4 U·L-1,分别是AOX1启动子的2.5和2倍。DAS2启动子与AOX1启动子的PPKex2表达量基本相同。另外,选择FDH1和GAP启动子构建双启动子共表达PPKex2菌株,但双启动子共表达菌株生长异常且PPKex2表达量低于单一FDH1启动子。（4）尝试通过截短PPKex2的C端基因和共表达CPR6、ESS1、HSP82、KAR2、SSA1、YDJ1、STI1七种伴侣蛋白来提高PPKex2表达量。但结果表明,两种方法均未提高PPKex2的表达水平。