苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种能产生芽胞的土壤细菌,在稳定期形成芽胞和大量的伴胞晶体形式的杀虫晶体蛋白。这种高效的蛋白表达及杀虫机制吸引了很多研究者的兴趣,但是晶体蛋白形成的分子机制和作用方式依然不是很清楚。本文主要以苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(subsp. kurstaki)标准菌株为材料,从苏云金芽胞杆菌芽胞期的特异转录因子σ35入手,试图找出σ35因子与晶体蛋白表达调控之间的关系,为阐明晶体蛋白形成机制的研究工作提供有力的证据。1.苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT1K-Plip-TS的构建。我们将枯草芽胞杆菌的非芽胞依赖的特异性的强启动子Hpall和cry1Ac基因的终止子都克隆到苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT1K载体上,构建了可以在细菌的营养期表达的穿梭载体pHT1K-Plip-TS。HpaⅡ特异启动子可以使基因在苏云金芽胞杆菌从营养期开始转录,而crylAc基因的终止子结构下mRNA比较稳定,所以可以实现基因在苏云金芽胞杆菌里在早期开始表达蛋白并积累。2.σ35基因过表达工程菌的构建。克隆了苏云金芽胞杆菌库克库斯塔克亚种kurstaki (HD-1)的σ35基因到苏云金芽胞杆菌穿梭载体pHT1K-Plip-TS上,构建了σ35基因过量表达载体pHT1K-Plip-35TS,并且成功的转化到了含有cry1Aa, cry1Ab等晶体蛋白的野生型的苏云金芽胞杆菌kurstaki (HD-1)中,命名为35/kur。这样使得到芽胞期才开始表达的σ35基因可以不依赖芽胞就能在苏云金芽胞杆菌的营养生长期时开始转录表达,并在细胞中积累超过正常水平。3.蛋白质表达水平的检测。σ35基因过表达菌株(35/kur)的晶体蛋白的表达量比野生的菌株HD-1高出约2倍。同时通过RT-PCR检测到σ35基因在过表达菌株35/kur中从对数期就开始转录,而野生株HD-1在稳定期的末期才检测到转录。检测还发现杀虫晶体蛋白Cry1Aa的转录在过表达菌株中也提前了。通过SDS-PAGE检测发现在翻译水平上,过表达菌株Cry1Aa蛋白没有检测到提前表达,而是和野生株一样到稳定期才开始表达,也就是说晶体蛋白从转录到翻译还需要有其他一些基因的调控来完成,可能是在营养生长期σ35因子的过表达解除了共用启动子的基因对于它的竞争作用,但转录后水平上的调控没有同时被激活。