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全球粮食系统的安全升级和医疗挑战的不断增加需要我们更好地监测和控制食源性致病菌危害。泛耐药菌的不断进化和流行,伴随食物链的传播,导致细菌耐药风险急剧上升,对食品安全和医疗资源带来严重挑战。亟需积极发掘新型杀菌、控菌策略。噬菌体裂解酶是大部分裂性噬菌体在裂解期释放一种蛋白,具有很强肽聚糖降解活性,与宿主细菌接触后能立即破坏其细胞壁结构,从而快速杀死细菌。近年来研究表明其可作用于食物链的各个环节,作为一种高效、安全、绿色、易获取策略,可靶向控制耐药性食源性致病菌。噬菌体是地球上最为丰富的生命形式之一,广泛分布于各种环境之中。随着高通量测序和宏基因组学的发展,可深度挖掘和丰富噬菌体裂解酶的生物信息资源,为噬菌体裂解酶的“结构特征”-“功能发挥”模式的系统性分析和理解奠定基础,为噬菌体裂解酶的合理寻找或个性化设计提供理论指导,驱动建立高通量、高效率、预见性的集约化生产平台和差异化设计的辅助扩展渠道,对下一代控菌策略的开发和耐药危机的应对具有现实意义。本研究以重要水产致病菌副溶血性弧菌为对象,创新性的从噬菌体裂解酶结构域出发,以现有数据库信息资源为基础,以生物信息学分析为手段,构建副溶血性弧菌噬菌体裂解酶表达载体,并对其酶学性质和多元化应用进行探究,为噬菌体裂解酶的发掘提供了一种新思路,为噬菌体裂解酶的系统发掘提供理论基础。主要研究内容及研究结果如下:1.副溶血性弧菌噬菌体裂解酶数据库筛选、生物信息学分析及表达纯化基于高通量测序技术的基因组学、宏基因组学快速发展,噬菌体裂解酶生物信息资源不断被挖掘和丰富。数据库中许多噬菌体裂解酶序列或预测的阅读框架尚未得到验证,为噬菌体裂解酶的筛选和重组表达提供了可靠来源。本研究以NCBI等数据库为载体,对弧菌噬菌体裂解酶生物信息资源进行系统性收集和分析。本研究共发现十类保守功能域:Lyz-like superfamily,Lyz-like superfamily＆PG＿binding＿1 superfamily,Lyz-like superfamily＆PG＿binding＿3 superfamily,PG＿binding＿1 superfamily＆NLPC＿P60 superfamily,Hydrolase＿2 superfamily,PGRP superfamily,Peptidase＿M15 superfamily,Mur NAc-LAA superfamily,Zli S和Phage＿lysis superfamily。进一步对已发掘的高裂解活性噬菌体裂解的理化性质分析和建模分析发现,其共有特征为阳离子残基较多分布在C端的α-两亲性螺旋,形成“突起残基”,促进穿透外膜屏障。通过系统生物信息学分析对噬菌体裂解酶进行筛选、优化和重组表达,最终获得3个噬菌体裂解酶Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis。2.噬菌体裂解酶Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis的酶学性质研究为确定Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis酶学性质以对其实际应用做理论指导,本研究系统性的探究了温度、pH、外膜渗透剂、NaCl浓度、金属离子等对酶活性的影响,探究了Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis对肽聚糖层的水解活性,其安全性及对63株副溶血性弧菌的裂解活性。研究发现Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis在30 min可杀死超过99%经氯仿预处理的副溶血性弧菌,表明三种噬菌体裂解酶均有高效的肽聚糖水解活性,1 m M EDTA能显著促进其对外膜的渗透。Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis表现出碱性酶性质,在pH=8-10范围保持较高活性,在45℃以下保持活性,在400-700 m M NaCl溶液中保持较高活性,Lyz＿V＿pgrp受金属影响较大而Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis相对稳定。Lyz＿V＿pgp60与Lyz＿V＿zlis对副溶血性弧菌的控制具有协同作用,其组合对63株副溶血性弧菌表现不同程度的控制效果,30 min处理最高可杀死48.56%的细菌载量。细胞毒性实验和小鼠体内实验均表明Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis是一种安全有效的副溶血性弧菌控制策略。3.噬菌体裂解酶Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis的多元化应用Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis具有高效的生物被膜水解活性,对48 h预形成的副溶血性弧菌生物被膜的清除率超过90%,在48 h内对副溶血性弧菌生物被膜形成的抑制率达80%以上。其中Lyz＿V＿pgrp和Lyz＿V＿zlis对生物被膜的降解活性强于Lyz＿V＿pgp60,Lyz＿V＿pgrp-Lyz＿V＿pgp60-Lyz＿V＿zlis及Lyz＿V＿pgp60-Lyz＿V＿zlis组合不会增加对生物被膜的降解活性,相反,会弱于Lyz＿V＿zlis单独处理时的效果。Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis可以不同程度导致多重耐药副溶血性弧菌对抗生素敏感,其中Lyz＿V＿pgp60可促使所有受试菌株对抗生素产生敏感回复。Lyz＿V＿pgp60与氨基糖苷类药物（Amikacin、Gentamicin）和喹诺酮类药物（Ciprofloxacin、Levofloxacin）联合使用具有协同作用,增强13%-43.42%的抗菌效果;Lyz＿V＿pgp60-Lyz＿V＿zlis组合能更显著的促进这一效果,30 min的协同处理使杀菌率提升17.82%-88.16%,120 min的协同处理可杀死99.95%的多重耐药副溶血性弧菌。在食品领域,Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis有效控制三文鱼样品、不锈钢刀具材料、竹和聚丙烯砧板材料表面的副溶血性弧菌,导致1±0.4 Log CFU/cm~2生物载量的降低。在环境领域,Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis可降低湖水和污泥中0.8-0.99 Log CFU/m L的副溶血性弧菌。总结:本研究本以副溶血性弧菌为控制目标,从噬菌体裂解酶“结构域”-“功能发挥”角度出发,以现有噬菌体裂解酶数据库信息资源为基础,以生物信息学分析结合湿法实验为手段,成功构建副溶血性弧菌噬菌体裂解酶表达载体,获得三种高活性噬菌体裂解酶Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis,并对其酶学性质和多元化应用进行探究。Lyz＿V＿pgrp、Lyz＿V＿pgp60和Lyz＿V＿zlis具有一定的抗菌活性和高效的生物被膜水解活性,与抗生素具有协同作用,表现出良好的生物被膜洗涤剂和抗生素辅助小分子的应用潜力。