背景:神经系统尤其是大脑的发育是一个复杂而被多重因素精确调控的过程。其中,甲状腺激素对脑发育起着至关重要的作用。多种原因导致的妊娠期甲状腺激素缺乏,将损伤子代的神经发育,导致神经分化和迁移的不可逆转的损伤。大脑皮层参与人类和动物的高级认知(例如语言、学习、抽象思维、情感)、感觉功能,自主运动功能等,甲状腺激素缺乏导致的后代智力低下,运动失调与大脑皮层功能障碍有关。甲状腺激素核受体(Thyroid hormone Receptor,TR),分为二种亚型:TRα1和TRβ1,分别由TRα和TRβ基因编码。这两种亚型在调控机体的发育具有不同的功能。其中,早期脑发育主要接受TRα1的调控。TRα1在脑组织发育早期即开始广泛表达,表达量占所有TR的60%;TRβ1主要在出生后表达且部位局限,仅占TR的30%。甲状腺激素对脑发育的调控存在时间、空间特异性,其机制目前不清。在脑组织结构中,大脑皮层是发育得最早的组织。人类孕8周开始,大脑皮层开始表达TRα1,大鼠研究中亦发现TRα1在母鼠孕11.5天出现(相当于胎鼠神经管形成时间),之后在脑组织中广泛表达,但是甲状腺激素缺乏导致大脑皮层损伤主要发生在母鼠孕16天之后,导致胎鼠大脑皮层神经元数量减少和神经元的成熟障碍(树突和轴突形成)、神经元迁移障碍等,但对神经管的形成、大脑皮层神经前体细胞的增殖无影响。尽管既往针对甲状腺激素对脑发育的影响研究较多,但大都集中在妊娠晚期及出生之后。甲状腺激素对胚胎期神经的早期发育的作用仍不清晰。不仅甲状腺激素对脑发育起着重要作用,妊娠期甲状腺自身抗体也会影响后代脑发育。流行病学调查表明,母体甲状腺自身免疫阳性的后代,其在智力评分、运动评分、外向型表达方面存在差异。因此,影响母体甲状腺自身抗体的因素对后代脑发育起着关键作用。近年来,铁对脑发育的影响已被越来越广泛的认知。在脑生长发育快速时期,脑摄取铁也最高。铁缺乏本身可导致大脑发育的不可逆损害,包括情感行为异常、认知功能下降和注意力缺陷等脑功能异常表现。尽管既往对铁和甲状腺激素分别对脑发育的影响研究较多,但铁与甲状腺激素及甲状腺自身抗体之间是否存在相互作用,并且是否可以共同对脑发育发挥调控作用这一过程仍不清晰。鸡卵白蛋白上游启动子转录因子(Chicken Ovalbumin Upstream Promoter Transcription Factors,COUP-TF)是属于核受体中孤核受体家族的一员,其有COUP-TF1和COUP-TF2两个亚型,它们在脑组织中广泛表达。研究发现:COUP-TF1在脑组织早期即表达,广泛表达于神经前体细胞和神经细胞中。母鼠孕7.5天时,胎鼠脑组织内可以检测到COUP-TF1,之后其在脑组织内广泛表达,孕13.5天在大脑皮层内的表达最高,之后显著下降。COUP-TF1在脑发育早期不同脑组织部位的高表达提示其在脑发育中可能发挥了重要的作用。条件性敲除大脑皮层内COUP-TF1的小鼠大脑皮层运动区扩大而感觉区缩小。即COUP-TF1基因敲除会改变大脑皮层发育的自然进程。甲状腺激素核受体α和COUP-TF1核受体在妊娠早期均开始出现,提示COUP-TF1和甲状腺激素核受体α极有可能共同参与了调控早期脑发育的过程。基于以上认识,本研究拟通过建立体外培养小鼠胚胎干细胞在体外定向诱导分化为锥体神经元的模型,探讨甲状腺激素对胚胎干细胞向神经元分化过程的影响。并利用慢病毒转染技术和CRISPR/CAS9技术获得COUP-TF1基因敲除的C57BL/6N ES细胞系,研究COUP-TF1对胚胎干细胞向神经元分化过程中对神经发育的影响。以及甲状腺激素和COUP-TF1是否存在对神经发育的共同作用。利用多中心大样本横断面研究,探讨在铁与甲状腺激素及甲状腺自身抗体之间是否存在相互作用。方法:本研究实验部分采用皮层神经元分化方法对小鼠胚胎干细胞(ESC)进行体外分化。小鼠ESC的皮层神经元分化发生在两个阶段,每个阶段使用特定的条件培养基。利用这种方法,我们能够在第一阶段获得高比例的巢蛋白阳性祖细胞,并在第二阶段分化中获得皮层神经元。采用免疫荧光及细胞电生理功能实验验证所分化的细胞为锥体神经元。在胚胎干细胞分化为神经元过程中各阶段用梯度浓度T3处理细胞时,采用Real time PCR、免疫荧光细胞化学检测T3对神经早期分化,增殖期,神经晚期分化的影响,以及分化神经元的突触生长情况,探讨T3对胚胎干细胞神经发育过程中的左右。利用Real time PCR分别检测TRα和COUP-TF1在胚胎干细胞向神经元分化过程中mRNA的表达情况。利用慢病毒转染技术和CRISPR/CAS9技术获得COUP-TF1基因敲除的C57BL/6N ES细胞系,利用Real time PCR、免疫荧光细胞化学检测和RNA Seq分析COUP-TF1对皮层神经分化的影响。在COUP-TF1敲除的胚胎干细胞分化为神经元的过程中给予梯度浓度的T3,分析COUP-TF1和T3对皮层神经分化的共同影响。本研究流行病学调查部分采用多中心横断面研究,将参加SHEP项目的7463名妊娠早期妇女和2185名拟妊娠妇女作为研究对象,对所有研究对象的血清TSH、FT4、TPOAb、TgAb、铁蛋白和尿碘水平进行了检测。结果:实验部分1、免疫荧光染色和细胞电生理功能实验验证胚胎干细胞体外分化的是具有功能的锥体神经元。2、在神经前体细胞分化,增殖期和神经元分化各阶段的第2天给予梯度浓度T3后。神经前体细胞:未见到形态改变,Nestin,Hes1,Hes5,Hairless,mRNA表达有增高趋势但无统计学差异;增殖期:未见到细胞数量的增多,Nestin,Hes1,Hes5,Hairless,β-tubulin III mRNA无统计学差异;在神经元晚期:神经元的数量和突触连接增加,Tbr1,Camk4 mRNA有统计学差异,p<0.05。并观察到Tbr1受甲状腺激素调控的时间窗。3、TRα1 mRNA在体外培养早期开始表达,随后表达稳定;COUP-TF1mRNA在体外培养早期开始表达并在第18天表达量最大,随后开始减低。4、应用贴壁法体外定向分化胚胎干细胞技术,在T3处理细胞的第22天发现神经元数量和突触连接增多。利用慢病毒转染技术敲除COUP-TF1后,采用生理剂量T3处理细胞,发现在神经前体细胞分化为神经元阶段,COUP-TF1和T3协同调控甲状腺激素靶基因Tbr1、RC3的表达。5、利用CRISPR/CAS9技术敲除COUP-TF1后促进神经前体细胞提前分化,Nestin的表达高于正常组细胞并具有统计学差异,p<0.05,并在中后期引起神经前体细胞的凋亡,在这一阶段末期COUP-TF1基因敲除的细胞Nestin的表达量显著低于正常组。6、COUP-TF1基因敲除同样促进不成熟神经元的提前分化,其β-tubulin III的表达高于正常组并具有统计学差异,p<0.05,但在这一阶段晚期β-tubulin III的表达量显著低于正常组,p<0.05。7、神经分化早期这一阶段选择第4天行RNA Seq检测,发现PI3K/Akt信号通路中rbl2下调,骨架蛋白Actin下调。流行病学调查部分1、在铁缺乏组的妊娠早期及拟妊娠妇女中均观察到的单纯TPOAb阳性的患病率显著上升。2、在铁缺乏组的妊娠早期及拟妊娠妇女均观察到血清T4显著降低。结论:1、用拟胚体法定向体外分化胚胎干细胞技术中,生理浓度甲状腺激素在胚胎干细胞向神经前体细胞分化期和增殖期无明显作用。但在神经元分化晚期,促进神经元的分化和突触的生长。2、TRα1和COUP-TF1在神经元分化晚期协同调控甲状腺激素靶基因Trb1和RC3的表达。3、COUP-TF1有维持细胞周期和骨架蛋白稳定的作用。敲除了COUP-TF1后可引起细胞脱离细胞周期G1期从而分化产生不成熟的细胞,并伴随凋亡。4、在妊娠早期及拟妊娠妇女中,铁缺乏与甲状腺自身免疫及甲状腺功能异常相关。