三角帆蚌细胞法育珠初步研究和alphja-2巨球蛋白基因克隆及其表达

来源 :上海水产大学 上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fuuxia
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本文首先对三角帆蚌外套膜外表皮细胞体外培养条件进行调整,测定三角帆蚌血淋巴液渗透压,以调整培养基的渗透压,接着利用MTT法测定细胞活力,得到活力较强的细胞,从而确定最佳消化时间。然后在体外条件下进行细胞培养,细胞3d后贴壁,培养效果良好。在此基础上,将获得的三角帆蚌外套膜外表皮细胞培养粘附在珠核表面,然后将粘附细胞的珠核插入育珠蚌体内,并补加部分细胞悬液,进行育珠。结果表明此种方法可以形成有核珍珠,初步证明了细胞法培育有核珍珠的可行性。   同时,利用α2M的作用机理对三角帆蚌α2M活性进行测定,首次证明了三角帆蚌体内α2M的存在。在α2M活性测定的基础上,克隆了三角帆蚌α2M基因cDNA全序列。三角帆蚌α2M基因的克隆,更进一步证明了α2M在三角帆蚌体内的存在。该基因全长5124bp,其中编码区4836bp,5端非编码区35bp,3端非编码区为253bp(含polyA尾31bp)。ORF编码1611个氨基酸,其中前23个氨基酸残基为信号肽序列,成熟蛋白分子量为177571.8D,等电点为5.49,且蛋白的不稳定系数为39.53,代表了成熟蛋白是稳定的。三角帆蚌α2M具有典型的α2M家族的保守性结构域,且与栉孔扇贝α2M具有最高的相似性。   α2M不同组织的表达检测结果显示,α2M基因在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肠和性腺中没有表达。利用半定量PCR的方法,研究了在病理条件下α2M的表达变化。三角帆蚌在注射大肠杆菌和嗜水气单胞菌12h后,其α2M的表达水平都有一定量的升高,充分证明了三角帆蚌体内以α2M为基础的免疫系统的存在。抗病功能基因α2M的克隆和功能研究对于三角帆蚌的免疫学研究以及抗病新品种的选育提供重要的理论基础。
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