人类肿瘤的发生、发展大多是由于基因的改变致细胞凋亡的异常引起的。人体常见的口腔肿瘤细胞中,survivin基因的水平一般都会升高,它会抑制细胞凋亡。细胞凋亡与增殖一样,是一个高度可调节性的生物化学过程。　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)成为近年来的热点研究之一,它是多种生物体内由双链RNA(double stranded RNA,dsRNh)分子介导的基因阻抑现象,通过导入外源或内源的dsRNA,细胞内加工后产生siRNA(小分子干扰RNA片段)可以特异性阻滞基因的表达,使内源性mRNA发生特异性降解,从而引起转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。由于这是一种在RNA水平的基因表达抑制,故称为RNAi。RNAi技术的应用领域已经从基因组学研究逐步扩展到医学领域并作为基因治疗手段。RNAi作为一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,将为肿瘤基因治疗开辟一条新思路。　　 研究显示,对细胞进行针对survivin基因特异的siRNA转染可以使得survivin基因表达抑制,从而显著增加细胞的凋亡率,即通过RNA干扰的特异性来抑制或灭活这些基因异常的表达,可以抑制肿瘤的发生和发展。RNA干扰由于其特有的优势而成为肿瘤基因治疗的新策略,针对肿瘤细胞特定靶基因的siRNA可沉默靶基因进而诱导细胞凋亡、抑制肿瘤、增强化疗或放疗的敏感性而发挥抗癌的作用。　　 虽然RNA干扰为我们展示了相当美好的应用前景,但是目前仍然还有一些问题阻碍其临床应用。由于RNA干扰是在细胞质中与其目标RNA发生相互作用,因此,siRNA分子如何跨过细胞膜到达目的细胞是关键问题。目前转运siRNA至细胞内主要通过病毒或非病毒载体,对于病毒载体,如慢病毒、腺伴随病毒等,虽然高效,但是安全性和毒性限制了它的发展；对于非病毒载体,它们的低效率是限制它们使用的主要因素,并且所有这些载体无法对RNA干扰的过程进行观察和监测,这些都是有待解决的问题。所以,要进行有效、安全并可对其进行观测的RNA干扰,取决于我们能否开发出一种新型的siRNA转染载体。　　 量子点(quantum dot,QD)是一种直径在1-100nm的半导体纳米颗粒,而粒径在2-10nm的量子点可通过内吞作用进入细胞。QD具有特殊的光学特性,单一种类的QD能按照尺寸变化产生发光波长不同、颜色分明的荧光,并且这种荧光的强度和稳定性都大大优于有机荧光染料,可以让研究人员更长时间地观察细胞或组织；此外,QD具有良好的生物相容性,对细胞的毒性低。QD表面经不同功能基团修饰后,可以通过静电吸引力、氢键作用或特异的配体受体相互作用将生物分子结合在QD表面。综上所述,量子点独特的光学特性及生物学特性可以帮我们解决传统转染载体的问题,所以,我们可以以QD为载体将siRNA转染到目的细胞里,靶向结合目标基因,达到RNA干扰的目的。近10年来,QD作为生物荧光标记物,逐步地应用于蛋白质及DNA的检测、RNA干扰、药物靶向治疗、活细胞生命动态过程的示踪及动物活体体内肿瘤细胞的靶向示踪等生物分析与医学诊断领域,并取得了丰硕的研究成果。　　 本实验利用量子点独特的光学特性、理化特性及生物学特性,对口腔鳞癌Tca8113细胞中高表达的凋亡抑制基因survivin siRNA进行修饰,探索以量子点为载体靶向survivin基因的siRNA的转运,并对转染过程进行实时监测、追踪,并进一步使得survivin mRNA的转录水平下降,抑制或灭活这些基因异常的表达,抑制肿瘤的发生和发展。探索出一种安全,低毒,高效并可进行实时观测的非病毒性siRNA转运载体,为RNA干扰技术提供新思路,在通过RNA干扰进行肿瘤基因治疗的同时还可进行影像学观察。　　 第一章量子点通过静电吸引力标记survivin siRNA的研究　　 目的　　 研究量子点通过静电吸引力标记survivin siRNA的方法,为后期以量子点为载体转染survivin siRNA进行RNA干扰的研究做前期准备。　　 方法　　 表面带正电荷的水溶性量子点(4μmol/L,下同),通过正负电荷的吸引力与表面带负电荷的survivin siRNA(20μmol/L,下同)结合,本研究在siRNA定量5μL的基础上改变量子点的量,在量子点的安全使用范围内取三种比例进行试验(12.5μL,7.5μL,2.5μL),并设立阳性对照组(siRNA组)、阴性对照组(QD组),通过4％琼脂糖凝胶电泳观察siRNA条带的亮度分析两者结合的最佳比例。　　 结果　　 4％琼脂糖凝胶电泳显示实验组2中:量子点通过静电吸引力标记人舌癌Tca8113细胞 survivin siRNA的最佳比例为 QD12.5μL:siRNA5μL(QD50pmol:siRNA100pmol),即为1:2。按每孔培养体积2ml计算,50pmol QD的使用终浓度为25nmol/L,该浓度在量子点的安全使用范围内。　　 第二章量子点为载体转染 survivin siRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞中的实时观察　　 目的　　 靶向survivin基因的siRNA通过量子点为载体转染至人舌鳞癌 Tca8113细胞中,并通过激光共聚焦显微镜对转染过程进行实时观察,期望在肿瘤治疗的同时可对其进行实时影像学观察。　　 方法　　 1.细胞培养、细胞接种:选用人舌癌Tca8113细胞。　　 2.表面带正电荷的水溶性量子点,通过正负电荷的吸引力与表面带负电荷的survivin siRNA以1:2比例结合成QD-siRNA复合物,使用前配制。　　 3.QD-siRNA复合物通过内吞作用进入细胞,激光共聚焦显微镜可对QD-siRNA复合物转染至细胞中的过程和分布情况进行实时动态观察。　　 结果　　 激光共聚焦显微镜观察显示QD成功将 survivin siRNA转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,并对其进行6h实时动态监测:　　 1.QD-siRNA复合物加入培养皿15min后开始吸附至细胞膜上,并慢慢穿透胞膜到达胞浆,直至6h可见QD-siRNA复合物充分进入细胞,QD主要分布在细胞质中,而siRNA在细胞质和细胞核中均有分布,说明survivin siRNA在进入细胞后对survivin基因有靶向性。　　 2.在两种荧光通道的对比下,显而易见,来自QD的红色荧光的强度大于来自siRNAFAM的绿色荧光,QD相对于FAM有机荧光更适于进行细胞动态观察。　　 第三章量子点为载体转染 survivin siRNA至人舌鳞癌 Tca8113细胞后对 survivin mRNA转录水平的影响　　 目的　　 靶向survivin基因的siRNA通过量子点为载体转染至人舌鳞癌 Tca8113细胞中,研究其对 Tca8113细胞中 survivin基因转录水平的影响,为量子点为载体在肿瘤的基因治疗方面提供实验依据。　　 方法　　 survivin siRNA通过量子点转染至人舌鳞癌 Tca8113细胞中,同时设立lipofectamine2000脂质体为转染载体的对照组以及未转染的空白组,采用实时定量RT-PCR检测各组Tca8113细胞转染后survivin mRNA转录水平的改变情况。　　 结果　　 实验组用50pmol QD转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin mRNA转录水平相当于空白组的36％(QD与siRNA的使用比例为1:2):对照组中用100pmol lipofectamine2000脂质体转染100pmol survivinsiRNA入 Tca8113细胞48h后,检测到survivin mRNA转录水平相当于空白组的10％(lipofectamine2000与siRNA的使用比例为1:1)。　　 统计分析显示:实验组、对照组与空白组的差异均有显著性意义(P<0.05),说明量子点和 lipofectamine2000转染survivin siRNA入 Tca8113细胞48h后,均能有效降低 survivin mRNA的转录水平。　　 全文结论　　 1.4％琼脂糖凝胶电泳证实:量子点通过静电吸引力标记survivin siRNA的最佳比例为 QD12.5μL:siRNA5μL(QD50pmol:siRNA100pmol),即为1:2。按每孔培养体积2ml计算,50pmol QD的使用终浓度为25nmol/L,该浓度在量子点的安全使用范围内。　　 2.激光共聚焦显微镜观察QD成功将survivin siRNA转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,并对其进行6h实时动态监测显示:QD-siRN复合物加入培养皿15min后开始吸附至细胞膜上,并慢慢穿透胞膜到达胞浆,直至6h可见QD-siRNA复合物充分进入细胞中:QD主要分布在细胞质中,而siRNA在细胞质和细胞核中均有分布,表现出 survivin siRNA在进入细胞后对survivin基因的靶向性。　　 3.实时定量RT-PCR分析得出量子点为载体转染survivin siRNA入Tca8113细胞后能有效降低细胞中survivin mRNA的转录水平。　　 4.综上所述,量子点不仅可以作为载体将survivin siRNA转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,并有效降低Tca8113细胞survivn mRNA的转录水平,而且可以作为一种标记物对siRNA转染的过程进行实时动态观察,同时表现出良好的光学特性,这有望应用于同步完成肿瘤治疗和肿瘤成像,指导临床治疗工作,为肿瘤治疗模式提供一个新思路。