脑血管病已经成为人类致死致残最主要的原因之一,其发病率有逐年上升的趋势,其中以缺血性脑卒中最常见。神经干细胞的发现和分离成功打破了神经组织损伤不能再生的传统观念。神经干细胞具有自我更新和多向分化能力,可在特定条件下增殖参与神经再生和组织修复,向神经元和胶质细胞分化,在体内受局部细胞因子和环境因素的影响,向病变区域缺失的细胞方向分化,并与宿主有良好的组织融合性,向病变区域归巢并参与神经网络形成,恢复神经组织结构,这些生物学特性使干细胞移植成为脑梗死治疗的最前沿方案之一。同时利用基因工程技术修饰干细胞,使神经元保护因子或蛋白在缺血边缘区表达增高,阻止受损神经元的坏死或凋亡,维持原有神经元的生理功能。骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）来源于中胚层发育的早期间质干细胞,属于多潜能性干细胞,存在于骨髓腔内,在一定条件下可被诱导分化形成神经干细胞,进一步形成神经元、胶质细胞。BMSCs作为供体细胞,具有胚胎干细胞和神经干细胞的很多特点;在临床上更容易从人体内获得骨髓细胞,损害轻微;自体移植也克服了使用胎儿组织所带来的伦理方面的问题。目前国内外相关研究大多将骨髓基质细胞直接移植到脑缺血区域,获得了令人振奋的治疗效果。通过立体定向或者开颅直接注射入损伤部位或者直接注射入脑室脑池,能将BMSCs直接送达受损部位,提高移植物抵达靶点的数量。因开创性手术对脑组织产生一定的损伤;不便多次多靶点注射;同时也存在无菌性蛛网膜炎和蛛网膜下腔粘连的危险。本研究选择经尾静脉注入骨髓基质细胞,简便、安全、快捷,一次可以输入较多数量的BMSCs,进入脑内的BMSCs分布在缺血坏死灶周边区。本研究主要解决的问题是BMSCs经尾静脉注射移植后,如何在活体内检测移植细胞的定向归巢和细胞增殖。本研究方法是使用活体示踪剂超顺磁性氧化铁颗粒Feridex（商品名:菲立磁）在磁共振下体内外观察被标记的BMSCs,监测BMSCs在脑内存活、增殖和向神经分化,分析对MCAO大鼠的神经功能评分改变的影响,评价经静脉注射移植BMSCs以及Feridex标记BMSCs的可行性。第一部分大鼠骨髓基质细胞的体外培养实验研究目的:探索大鼠骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）的体外培养方法。方法:体外分离60~90 g SD（Sprague-Dawley）大鼠骨髓,贴壁法扩增培养大鼠BMSCs,相差显微镜观察原代及不同传代细胞的生长特性及形态变化,并进行细胞表型鉴定和巢蛋白（nestin）、神经元特异性核蛋白（Neuronal specific neucleoprotein ,NeuN）、胶质原纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein ,GFAP）免疫细胞化学鉴定。结果:培养的BMSCs传代12小时后贴壁率高达95%,在第3代纯度可达到92%。大鼠BMSCs经分离纯化并传代后能表达nestin、NeuN、GFAP等特异性标记物,传到第3代后镜下nestin阳性细胞率为80.1%,GFAP阳性细胞率为28.7%,NeuN阳性细胞率为14.5%。结论:传3代的细胞可作为理想细胞移植治疗的细胞来源。第二部分Feridex标记骨髓基质细胞体外实验研究目的:应用超顺磁性氧化铁Feridex和阳离子转染试剂多聚赖氨酸（PLL）复合物Feridex-PLL体外标记大鼠骨髓基质细胞（BMSCs）,初步评价磁共振成像示踪Feridex标记BMSCs的可行性。方法:体外分离60~90 g SD大鼠骨髓,贴壁法扩增培养大鼠BMSCs,并用Feridex-PLL体外标记,用普鲁士蓝染色和台盼兰排斥试验鉴定细胞内铁以及标记细胞的活性;利用MRI不同序列快速自旋回波（TSE）脉冲序列TSE-T1WI、TSE-T2WI、FFE-T2WI分别对Feridex-PLL标记后BMSCs和未标记BMSCs按1×105、5×105、6×105不同细胞数量进行成像,分析其信号强度值和强度变化率（?SI）与不同序列、标记情况和标记细胞数量的关系。结果:Feridex-PLL对BMSCs体外标记率近100%,对细胞形态和活性无明显影响。未标记细胞在TSE- T1WI、TSE-T2WI与FFE-T2WI之间的信号强度无统计学差异。细胞标记与不标记间的MRI各序列信号强度之间差异显著（P<0.001）,前者随着细胞数量的增加而增强。各序列信号强度测量值在细胞是否标记与标记细胞数量之间交互效应较大。3个序列中以FFE-T2WI的信号强度变化率（?SI）最大,对磁标记细胞的显示最为敏感。在各成像序列上不同标记数量的细胞与未标记细胞之间的信号强度显示明显的统计学差异（P<0.001）。各序列?SI在细胞是否标记与标记细胞数量之间有较小的交互效应。结论: MRI成像显示标记后1×105个细胞即可引起明显的信号改变,FFE-T2WI序列最为敏感,信号强度与细胞数量明显相关,非常适用于BMSCs体内外的示踪研究。Feridex-PLL是BMSCs比较理想的示踪剂,标记率高。第三部分线栓法制备MCAO大鼠模型目的:用线栓法制作SD大鼠大脑中动脉梗塞（MCAO）模型,方法简单、易行、梗塞范围恒定、模型稳定。方法:选用健康、成年雄性清洁级SD大鼠100只,用线栓法堵塞大脑中动脉2h,再灌注后3d内Zea-Longa评分2～3分为成功模型。模型制造后3d、7d通过神经功能缺损严重程度评分（modified Neurological Severity Scores,NSS）和横木行走实验（Beam walking Test,BWT）评分观察其行为学改变,同时行MRI检查了解各序列梗塞病灶变化情况,再灌注后7d断头取脑,进行TTC染色及HE染色观察梗塞情况。结果:技术未成熟时模型制备再灌注24小时内模型成功率为52%,3日内模型成功率为35%。后期模型制备的28只老鼠3日内成功率75%,死亡率和失败率均低。35只成功大鼠模型的行为学评分:缺血再灌注后3天NSS 7.63±2.613分,7天NSS 6.97±2.760分,二者的有显著的统计学差异（P=0.006 ）;缺血再灌注后3天BWT评分5.23±1.864分,7天BWT 5.03±2.062分,二者无统计学差异（P=0.393）。成功模型MRI扫描可见大鼠脑组织水肿明显,T2WI示显著高信号,一周时水肿达高峰期;动态观察水肿程度随时间呈不同程度缓解;T2WI信号递减,以梗塞周边区明显。TTC染色见梗塞病灶范围基本恒定。结论:技术成熟后,线栓法可制备稳定的MCAO大鼠模型,能作为脑梗塞实验研究的模型。第四部分Feridex标记BMSCs经尾静脉注射移植治疗MCAO大鼠及MRI示踪目的:评估核磁共振示踪观察Feridex标记移植后BMSCs存活、定向归巢能力和分化的效果。方法:选用健康、成年雄性清洁级SD大鼠100只,随机分成经尾静脉注射移植治疗组（SPIO-BrdU-BMSCs移植组,细胞数3×106,20只）、梗塞对照组（梗塞后SPIO-PLL单独注射,20只）、假手术移植组（SPIO-BrdU-BMSCs移植,细胞数3×10~6,20只）、空白对照组（正常大鼠经尾静脉注射等容量PBS,20只）、经颈动脉注射移植治疗组（SPIO-BrdU-BMSCs移植组,细胞数2×106,20只）。缺血再灌注后7d经静脉或者动脉注射,按注射后处死时间3d、7d、14d、28d分成亚组,每亚组均为5只大鼠。经尾静脉或者颈动脉注射移植Feridex-PLL和5-溴脱氧尿核苷（5-bromodeoxyuridine ,BrdU）双标记的BMSCs或者经尾静脉注射Feridex- PLL、PBS,在各时相点分别进行大鼠行为学评分、MRI各序列信号观察、取脑组织石蜡切片后进行普鲁士蓝染色及免疫组化染色、免疫双标共聚焦观测。结果:经尾静脉细胞移植后MCAO大鼠的神经功能评分NSS、BWT在28d时较梗塞对照组有所提高（P<0.05）,改善程度稍小于经颈动脉移植组,但无统计学意义（P>0.05）。静脉移植组普鲁士蓝染色的阳性细胞基本在梗塞边缘较密集分布,MRI显示MCAO大鼠脑内梗塞灶周围环形或片状T2WI和FFE-T2WI明显低信号;经颈动脉移植对照组的MCAO大鼠普鲁士蓝染色可见梗塞侧弥散分布较多的阳性细胞,MRI显示梗塞侧弥散低信号;与两组的免疫组化结果相吻合。结论:经尾静脉注射移植BMSCs可改善MCAO大鼠的神经功能损害。Feridex可以用于BMSCs移植的活体示踪。