五倍子单宁酸的提取、降解菌株筛选及代谢产物研究

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五倍子是倍蚜类昆虫在漆树科(Anacadiaceae)植物盐肤木Rhus chinensis Mill.、青麸杨Rhus potanninii Maxin.或红麸木上形成的虫瘿,为我国特有的林产品。其主要药效成分单宁酸及单宁酸水解产物没食子酸均具有广泛的工业应用,市场需求量巨大。传统上将五倍子中提取的单宁酸通过碱法、酸法水解制备没食子酸,具有设备腐蚀严重及污染环境等缺点。因此探索五倍子单宁酸高效提取及绿色无污染的没食子酸生产工艺具有重要的应用价值。本研究建立了五倍子单宁酸超声、微波、负压提取的响应面优化模型,比较了3种提取方法在提取温度、液固比、单宁酸提取率等方面的异同。超声辅助提取五倍子中单宁酸的优化工艺条件为:液固比38:1(mL:g)、提取时间32min、提取功率250W,单宁酸提取率为66.01%,与模型预测值(63.563%)的相对误差为3.85%,因而由该模型推测得到的最优工艺参数对实际的预测较为可靠。微波辅助提取五倍子单宁酸的最佳优化条件为:微波功率600W、液固比32:1(mL:g)、提取时间7min、提取温度62℃,单宁酸提取率为65.13%,与模型预测值(63.80%)的相对误差为2.1%。负压提取五倍子单宁酸的优化工艺条件为:提取温度55℃、液固比24:1(mL:g)、提取时间30min,单宁酸提取率为66.56%,与模型预测值(67.353%)相对误差为1.18%。3种提取方法的回归方程显著,相对误差均<5%,表明预测值与试验值之间具有较高的拟合度,可用于实际预测,为五倍子单宁酸提取新工艺的产业化提供了有效借鉴。为建立微生物降解五倍子单宁酸生产没食子酸的方法,以五倍子单宁酸为诱导物,通过平板划线从五倍子水提取液自然生长的菌落中分离纯化出16株菌。通过平板变色圈及TLC初筛及以单宁酸降解率、没食子酸积累浓度、单宁酶活力为指标进行复筛,筛选出单宁酸的高效降解菌株lhs-1。通过传统的形态学鉴定,包括在土豆培养基、察氏培养基、单宁酸培养基上的菌落形态及土豆培养基上的菌丝形态,以及以18s rDNA序列特征分析为依据建立的系统进化树,发现菌株lhs-1与Aspergillus niger HKS11及Aspergillus sp.LQ21亲缘关系最近,相似度最高,将其鉴定为曲霉属,并可能属于该属中的黑曲霉变种。论文采用3因素3水平的Box-Behnken响应面设计法对菌株lhs-1的发酵条件进行优化,测定培养温度、培养基初始pH、培养时间对该降解五倍子单宁酸生产没食子酸的速率(即单宁酶活力)的影响。结果表明:菌株lhs-1最适培养温度为31℃、培养基初始pH为5.0、最适培养时间为50h。在该最适条件下,菌株lhs-1单宁酶活力可达1.17U· mL-1。为了进一步研究菌株lhs-1发酵降解五倍子单宁酸的代谢产物,应用甲基化裂解气质(Py-GC-MS)分析了单宁酸标准品、五倍子水提取物及菌株lhs-1发酵液裂解产物的异同,通过与Nist02标准质谱库比对,结合质谱解析,共指认其中17种化合物,并按面积归一法计算出各化合物的相对含量。结果表明三种样品的甲基化裂解产物均可分为线性和苯环类两种,其中线性化合物可能是葡萄糖的甲基化裂解产物,苯环类化合物可能来源于没食子酸及没食子酸与葡萄糖形成的酯键和两个没食子酸形成的缩酚羧键的裂解。菌株lhs-1在五倍子水提取液中的代谢产物经甲基化裂解后,无论是线性还是苯环类化合物均进一步简化,且含量显著降低,仅有10种化合物的含量超过0.6%,其中没食子酸的甲基化裂解产物3,4,5-三甲氧基苯甲酸甲酯及没食子酸与菌体蛋白结合的甲基化裂解产物3,5-二甲氧基-4-羟基苯酰肼的总含量为48.97%,约为五倍子水提取物中的3.6倍。代谢产物中几乎不含有高聚合度的单宁酸,菌株lhs-1将五倍子水提取液中的单宁酸大量降解为没食子酸及少量低分子量的酚类物质和葡萄糖。Py-GC-MS法在分析发酵液中单宁酸及没食子酸的含量中具有良好的重现性,有一定的应用价值。
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