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目的通过pGC-SPAG6-shRNA重组慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因后,探讨SPAG6基因与人骨髓增生异常综合征(MDS)细胞凋亡的关系及其机制,为MDS的靶向治疗奠定基础。方法1.明确SPAG6-sh RNA慢病毒载体对人SPAG6基因干扰效率:将SPAG6-sh RNA及NC-sh RNA慢病毒转染人MDS细胞株SKM-1细胞后,利用荧光显微镜观察其表达情况,流式细胞术检测其转染效率,q RT-PCR及western blot验证SPAG6基因是否被成功干扰。2.探索SPAG6基因的表达对TRAIL信号通路活化的影响:慢病毒转染SKM-1细胞后,利用流式细胞术检测细胞凋亡,western blot检测TRAIL通路相关蛋白的表达情况。3.研究SPAG6基因与TRAIL凋亡通路之间的量的依赖性:同时利用不同浓度的r TRAIL蛋白处理SKM-1细胞,相同浓度r TRAIL蛋白分别处理SKM-1、U937及K562三种细胞,利用流式细胞术检测细胞凋亡情况,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,western blot检测TRAIL通路活化情况。4.探索SPAG6在TRAIL凋亡信号通路中的作用途径及关键分子:采用q RT-PCR及western blot检测TRAIL通路相关受体及蛋白的表达水平,免疫沉淀检测二者的结合情况。结果1.SPAG6-sh RNA慢病毒成功转染人SKM-1细胞。在荧光显微镜下观察到大量的绿色荧光,流式细胞术检测得其转染率分别为(97.19±3.21)%与(88.31±12.81)%,QRT-PCR及Western blot结果显示SKM-1细胞中SPAG6基因在m RNA及蛋白层面的表达均被成功抑制。2.SPAG6基因表达降低后,TRAIL凋亡通路被活化。干扰组的凋亡率明显高于对照组(NC-sh RNA 8.65%±2.07%vs.SPAG6-sh RNA20.20%±2.11%,P<0.05)。而且,SPAG6干扰组cleaved PARP、caspase-8以及cleaved caspase-8表达水平均升高,PARP表达则无明显差异。同时,BAK、BAX、BID和caspase-3较对照组表达也明显升高。3.SPAG6基因能抵抗r TRAIL蛋白引起的凋亡。随着r TRAIL蛋白浓度的增加,SKM-1细胞凋亡率增加,增殖被抑制,且TRAIL通路活化的相关蛋白表达增加。而利用相同浓度的r TRAIL蛋白处理SKM-1、U937及K562时,在U937及K562中,细胞凋亡及增殖均无明显区别。4.SPAG6能影响FADD与TRAIL通路受体间的相互作用。SPAG6基因表达被干扰后,FADD的表达较对照组明显升高,而DR4及DR5的表达则无明显区别。免疫沉淀的结果则表明,降低SPAG6表达后,FADD与DR4和DR5之间的相互作用明显增加。结论SPAG6基因能够通过影响TRAIL信号通路的活化调控SKM-1细胞的凋亡。其具体机制可能是细胞内SPAG6基因的高表达能够影响FADD的表达,进而致使FADD与TRAIL通路凋亡受体结合减少。