一、研究背景肝癌是全世界第五位的常见癌症,中国第三位的常见癌症。肝细胞性肝癌(HCC)约占原发性肝癌90%以上,预后不良。死亡率与发病率一致性地很高。据统计每年有超过50万新增肝癌患者,中国14个肿瘤登记处合计的肝癌发病率为30.3/10万,却占肿瘤致死原因的第3位。目前肝癌的病因及确切分子机制仍不完全清楚。多数流行病学调查表明在肝细胞性肝癌的主要危险因素中,长期酒精摄入是一重要的环境危险因素,其研究也越来越受到科研人员的重视。有充足的证据认为酒精与包括肝脏在内的所有消化道肿瘤和乳腺肿瘤的发生有关。另有许多流行病研究表明酒精与肿瘤的发展有关,比如影响肿瘤从腺瘤发展到癌瘤,同样也可能促进患有高危性息肉的恶性生物学进展。然而酒精对肝癌恶性发展的研究不多,其中的具体机制也未阐明。血管发生是实体肿瘤生长和浸润的先决条件。为生长超越微观大小,原发性的肿瘤和微小转移灶必须激活血管的发生。近业研究表明与肿瘤新生血管化的生物分子标记如血管内皮生长因子(VEGF)等被证实在如口腔和口咽部肿瘤治疗中提供了实用的预后信息,其刺激内皮细胞增殖和增加血管通透性,促进了肿瘤血管的生成。此外,炎症性的肿瘤微环境在肿瘤发生与发展中起着重要的作用,其包括缺氧微环境的产生,促进了血管发生和肿瘤的侵袭。近来认为单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是血管形成的化学因子与肿瘤侵袭转移密切相关。活性氧分子(ROS)被认为在肿瘤的发生中发挥了重要的作用,其机制为氧化应激引起的氧化损伤,炎症和脂质过氧化。ROS和抗氧化剂之间的平衡对控制癌细胞的生长是非常重要的。如果这一平衡被打破,会导致细胞氧化应激,其在肿瘤恶性发展具有决定性的作用。酒精损伤的一个重要特征是细胞内的ROS水平增加,其是通过细胞色素P450酶的代谢产物引起的。大量研究证实,ROS和NF-κB之间存在密切关系:而NF-κB是非常重要核转录因子与肿瘤恶性生物学行为密切相关,被认为是炎症相关肿瘤的启动因子,是多种信号转导途径的汇聚点。它的活化能促进肿瘤转移相关基因细胞粘附分子(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、金属蛋白酶-9(MMP-9)等的表达,参与细胞增殖、分化、迁移和粘附能力以及细胞周期与分化的调控;其还能诱导血管内皮生长因子的表达,促进血管形成,与肿瘤的发生、生长和转移等多个过程有关。本实验的研究目的有二:一是通过流行病学观察临床肝细胞性肝癌患者饮酒情况,分析其与肿瘤临床病理特征及肿瘤恶性生物学之间的相关性。二是通过体外内的实验方法探讨酒精刺激后对肝癌肿瘤的恶性生物学进展影响。期望通过上述研究进一步认识酒精在肝癌肿瘤恶性进展中的可能机制,为其治疗提供新的思路和方法。二、研究目的1.通过临床病例资料观察肝癌患者饮酒情况,分析饮酒与肿瘤病理特征及其恶性生物学之间的相关性。同时了解不同组别之间肿瘤组织VEGF和MCP-1的表达以及NF-κB通路活化情况来探讨慢性饮酒在肝癌恶性发展中的可能作用。2.在体内建立小鼠饮酒模型,观察酒精喂养对裸鼠Hep G2移植瘤肿瘤的生长和肺部转移情况的影响;在体外实验中观察酒精刺激对Hep G2细胞增殖、迁移能力及血管生成的影响;并对其可能的机制进行探讨。三、研究内容第一部分慢性酒精摄入促进原发性人肝细胞性肝癌的进展和转移取自安徽医科大学第一附属医院2009年1~12月行手术切除肝癌且术后经病理检查确诊为肝细胞性肝癌的住院患者。术前患者均未接受任何抗癌治疗,共52例肝癌组织标本。对肝癌患者的饮酒情况资料进行统计学分析,并采用免疫组化的方法判断CD34,VEGF和MCP-1以及NF-κB的表达。选4~5周龄的裸鼠分为2组:对照组和酒精组,每组各7只随机分组。酒精组小鼠昼夜交替给予含2%无水乙醇的饮用水,对照组昼夜饮用普通饮用水。取生长状态良好对数期生长的Hep G2细胞,注射于裸鼠背部。每2天观察小鼠肿瘤生长状况,称重,待肿瘤长出之后,每三天测量并计算肿瘤体积。待5周以后处死解剖小鼠,取出肿瘤组织送病理HE染色和免疫组化检测CD34、VEGF和MCP-1的表达,同时取出肺组织,观察肿瘤转移情况。在体外实验中用终体积为0.2%酒精刺激培养的Hep G2细胞。分组为正常对照组和0.2%酒精组。采用流式细胞术方法检测Hep G2细胞内ROS水平,Western blot法检测胞浆和胞核NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表达以及ERK和JNK信号通路的活化情况,RT-PCR和ELISA方法检测VEGF和MCP-1的基因表达和培养上清液蛋白含量。同时采用MTT方法、划痕实验和Transwell方法分别检测酒精对肿瘤细胞的增殖和迁移/侵袭能力,在体外建立三维血管生成模型来观察血管生成的情况。另外,为了评价NF-κB特异性抑制剂PDTC对肝癌移植肿瘤的生长情况,我们使用PDTC给裸鼠腹腔注射(100 mg/kg),每三天腹腔注射一次并计算肿瘤体积。第二部分酒精刺激促进肝癌肿瘤的恶性生物学进展及作用机制四、研究结果第一部分收集52例肝癌术后组织标本,其中男性45例,女性7例,年龄22~74岁,中位年龄50岁,平均年龄为49.8±12.1。从未饮酒28例,长期饮酒24例。与无饮酒史的肝癌患者相比较,饮酒史的肝癌患者中TNM分期恶化和门静脉浸润比率明显升高(分别为76.9%vs 35.9%,P=0.01,88.9%vs 37.4%,P=0.014)。饮酒量在35~87.5 g酒精的中等量饮酒患者与无饮酒患者相比较,存在明显的TNM分期恶性进展和门静脉浸润的高危险度,其的相对危险度分别为16.67和33.7。有饮酒史的肝癌患者生存时间与无饮酒史的肝癌相比,其一年生存率和三年生存率分别为75%vs57.15%和62.5%vs 35.7%(P=0.021)。与肝硬化组和远隔的非癌肝脏组织相比,无饮酒的肝癌肿瘤组织微血管密度明显升高(分别为42.6±4.82 vs 27.2±1.48和42.6±4.82 vs 16.2±4.43,P均<0.01),而在饮酒史的肝癌肿瘤组织中表达最高(61.0±6.78)。与无饮酒史的肝癌相比,VEGF/VEGFR-2和MCP-1/CCR2的表达在饮酒史患者中明显升高。在肝癌组织中NF-κB呈强阳性表达,主要表达于癌细胞的胞浆和胞核内,呈淡黄色至棕褐色的颗粒状物质。与无酒精摄入史的肝癌患者相比,有饮酒史患者的肝癌组织中胞浆和胞核NF-κB的染色更深。第二部分建立起小鼠饮酒动物模型并成功复制出人肝细胞性肝癌移植成瘤模型。2%酒精组移植瘤重量明显高于饮水对照组,其重量分别为0.95±0.1 g和0.38±0.03g,两组别间P值<0.05。酒精组肺转移率明显高于正常对照。酒精组小鼠移植瘤里微血管明显丰富于饮水对照组。形态学测定量化分析两组的微血管密度分别为64.6±8.92 vs 34.3±3.83,其P值<0.05。在24和48 h时相点酒精刺激后两组别之间的Hep G2细胞增殖能力没有统计学的差异。划痕实验和Transwell方法显示,划痕后培养12、24和48h时相点酒精明显加速了Hep G2细胞向中央划痕区的迁移能力和从上室向下室的迁移能力。在体外利用Hep G2细胞建立3-D肿瘤细胞-内皮细胞共培养系统,其结果显示在HUVEC单独培养系统中平均出芽率27.3%,而在HUVEC与Hep G2共培养系统中平均出芽率为42.9%。另外,在HUVEC与Hep G2共培养系统中,与培养基对照相比,加入0.2%酒精刺激后,其平均出芽率为67.9%,两组有明显统计学差异(P<0.05)。0.2%酒精刺激Hep G2细胞后,其VEGF和MCP-1 m RNA的水平较对照组明显升高,且呈时间依赖性。而酒精刺激12、24和48 h后的培养上清液里VEGF和MCP-1蛋白含量同样也明显高于对照组。在体外实验中0.2%的酒精刺激30 min后Hep G2细胞内ROS的相对水平为8.54±1.32,而其正常对照组ROS的相对水平为1.37±0.36,两组间有明显的统计学差异(P<0.05)。酒精刺激后Hep G2细胞胞浆P65蛋白较对照组明显降低,而胞核内的P65蛋白表达水平较胞浆明显升高。抑制蛋白IκBα的表达在酒精刺激后明显下调,而其磷酸化水平蛋白明显上调。0.2%酒精刺激后Hep G2细胞内磷酸化的ERK和JNK明显高于对照PBS刺激组,且随着时间,在酒精刺激24 h达到最高峰,而总的ERK蛋白水平没有明显变化。另外,在小鼠体内实验中酒精组移植瘤的VEGF和MCP-1的表达明显高于饮水对照组和PDTC组。而酒精+PDTC用药组与酒精组相比,VEGF和MCP-1的表达明显下调且肿瘤呈现明显缓解的生长速度。五、研究结论1.通过临床资料研究初步揭示了长期慢性中等量的酒精摄入明显增加了肝癌患者的肿瘤恶性进展。另外,酒精可能通过活化NF-κB信号通路上调VEGF和MCP-1表达从而促进肿瘤浸润和转移。2.成功建立了模拟人类慢性饮酒环境的小鼠肿瘤模型。酒精促进裸鼠肝癌移植瘤肝癌肿瘤血管的生成,加速肿瘤的生长以及肺部转移能力。在体外证实了酒精刺激后可增强Hep G2细胞的迁移能力以及促进新生血管的生成,并可能通过氧化应激反应介导NF-κB信号通路的活化并依赖于VEGF和MCP-1的高表达,进而导致一系列肿瘤细胞恶性生物学行为的发生,促进肝癌的浸润转移。