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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种猪的急性、高度接触性传染病,以腹泻、呕吐、脱水等为主要临床特征特征,给我国养猪业造成了巨大损失。临床上该病与猪传染性胃肠炎、轮状病毒病症状相似,较难进行鉴别诊断。为了探究PEDV的分子流行病学特点并建立有效的诊断方法,本研究主要开展了以下几个方面的工作:1.PEDV主要结构基因的遗传变异分析2013-2014年于北京、河南、陕西、广东、山东5个省市采集的猪流行性腹泻(PED)阳性病料,设计特异性引物对结构基因S、M、N进行克隆及测序,与国内外主要毒株进行比较,分析序列变化和遗传变异情况。序列比对结果显示,1株为弱毒株,其余4个样品株的S基因与国内疫苗株CV777差异较大,突变主要存在于S1区。S基因氨基酸序列存在5个氨基酸的插入(59QGVN62 and 140N)和2个氨基酸的缺失(163NI164),S1区的2个中和表位(499~638aa和764~771aa)有7处氨基酸突变。M、N基因的核苷酸序列相对保守,只存在部分氨基酸突变。遗传进化分析结果显示,4个样品株与亚洲主要疫苗株(中国疫苗株CV777、韩国弱毒疫苗株DR13以及日本弱毒疫苗株83P-5)同源性较低(93.8%~94.7%),亲缘关系较远;与2007~2009年韩国毒株,2011年日本毒株以及中国近年流行毒株同源性较高(96.0%~99.6%),亲缘关系密切。2.PEDV BJ-1株M、N、S1融合蛋白的表达和抗原性分析将样品株BJ-1的M、N和S1基因克隆至原核表达载体p GEX-6p-1,转化感受态细胞BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示M、N、S1重组蛋白获得表达,大小分别为50KDa、80KDa、110KDa,以包涵体表达形式为主。Western blot分析结果表明3种重组蛋白能被PEDV猪阳性血清特异性识别,具有良好的抗原性,可以作为诊断抗原用于特异性检测PEDV感染。3.PEDV N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化重组PEDV N蛋白作为包被抗原,优化各项反应条件,初步建立了可以检测PEDV血清中N蛋白抗体的间接ELISA检测方法。本研究中最终优化的反应条件为:N蛋白的最佳包被浓度为0.5?g/m L,最佳包被时间为37℃2h后4℃过夜(10~16h),5%脱脂牛奶37℃封闭3h,血清样品最佳稀释度为1:400,37℃作用1h,兔抗猪酶标二抗最佳稀释度为1:40,000,37℃作用1h,抗体临界值为OD450nm?0.40判为阳性,OD450nm<0.40判为阴性。试验证明该方法具有较好的敏感性、特异性、重复性和符合率,表明PEDV N蛋白间接ELISA抗体检测方法初步建立,可以用于猪PEDV血清抗体的检测和流行病学调查。综上所述,本研究分析了PEDV样品株结构基因中M、N、S的序列变化和遗传变异情况,为研究PEDV毒株的变异情况提供理论参考;成功表达了M、N、S1重组蛋白,具有良好的反应原性,为建立针对结构蛋白的检测方法奠定基础;用纯化的重组N蛋白,成功建立了PEDV N蛋白间接ELISA抗体检测方法,为PEDV的血清学诊断和流行病学调查提供了一种简便的检测手段。