研究背景细胞死亡的模式通常包括坏死(Necrosis)和凋亡(Apoptosis)。细胞凋亡不同于细胞坏死,它有其独特的形态学和生物化学改变特点,一般认为它是由于外来因素触发了细胞内预存的死亡程序而引发细胞的自杀过程。适度的细胞凋亡是组织器官正常发育过程中的生理性事件,凋亡过度或者不足则可导致组织器官的器质性病变和功能障碍。心肌细胞通常被认为是终末分化细胞,自诞生后基本丧失分裂、增殖潜能,心肌细胞过度凋亡可导致心脏有效收缩单位减少,从而对心脏结构和功能产生重大影响。心肌细胞凋亡受众多因素的影响,如急性心肌缺血缺氧、氧自由基、机械压力、细胞内钙离子超载和血管紧张素、醛固酮等神经内分泌激素以及肿瘤坏死因子-α、白介素-1等细胞因子。研究发现在缺血缺氧引起的心肌细胞损害中,首先出现了大量的细胞凋亡,而细胞坏死是随后发生的,说明凋亡是伤后早期心肌细胞死亡的主要形式之一。有研究表明,细胞过度凋亡也是引起烧伤早期大鼠心肌细胞损伤和心功能损害的重要原因。因此,如何有效抑制心肌细胞过度凋亡,是防治烧伤后心肌损害和心功能不全的一个重要措施。胰高血糖素样肽1(Glucagon-like peptide 1, GLP-1)是主要由远端回肠、结肠和直肠的Langerhans细胞分泌的一种多肽类肠促胰岛素,它主要通过结合特定的受体—胰高血糖素样肽1受体(Glucagon-like peptide 1 receptor, GLP-1R)产生作用。其主要作用有：葡萄糖依赖性地刺激胰岛素分泌；抑制胰高血糖素分泌；抑制胃肠道蠕动和胃液分泌,延迟胃排空；促进胰岛β细胞再生,抑制其凋亡等。GLP-1R除在胰腺组织表达外,还存在于脑、肺、心、肾等脏器。分布的广泛性决定了它作用的多样性。Zhao等通过对大鼠离体正常心脏和心脏缺血/再灌注模型进行研究发现,GLP-1除了可以直接作用于心脏,降低左心室等容收缩压和等容收缩期左心室内压力上升/下降的最大速率；还可通过增加一氧化氮的合成,从而显著增加心肌葡萄糖的摄取和葡萄糖转运体-1的易位；GLP-1尚可促进缺血30 min后心脏功能的恢复,尤其是使左心室舒张末期压力得到显著改善。提示GLP-1具有多方面的心功能保护作用。另有研究证实GLP-1可以直接作用于体外培养的心肌细胞,对缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤产生一定的保护作用,其机制可能主要是通过抑制心肌细胞的凋亡而产生的。虽然有多项研究表明GLP-1具有抑制细胞凋亡的作用,但是GLP-1在体内很容易被二肽基肽酶-Ⅳ(Dipeptidase IV, DPP IV)降解,半衰期不足2分钟,难以进行动态观测,从而限制了它在动物实验中的应用。后来人们从美洲希拉毒蜥的唾液中分离得到Exendin-4,它是GLP-1的长效拟似物。初步研究表明Exendin-4与GLP-1作用于同一受体—GLP-1R,产生相似的生物学效应,如降血糖、促胰岛素分泌、改善胰岛功能、抑制胰岛β细胞凋亡等。GLP-1仅有31个氨基酸残基,而Exendin-4多了8个C端结合部位的氨基酸残基,因此Exendin-4与受体的亲和力比GLP-1更高。与GLP-1相比,Exendin-4的N端第二个氨基酸为甘氨酸,不会被二肽基肽酶-Ⅳ分解,血浆半衰期更长。Exendin-4能否参与影响烧伤后的心肌细胞凋亡过程?目前在国内外尚未有相关报道。本研究采用30%TBSAⅢ°烫伤大鼠模型,应用GLP-1的长效拟似物Exendin-4进行干预,通过检测伤后早期心肌组织GLP-1R表达、心肌细胞凋亡指数及心肌组织半胱天冬酶3(Caspase-3)活性的变化,探讨Exendin-4及GLP-1对烧伤早期心肌细胞凋亡的作用及相关机制。研究目的1.分别了解烫伤早期及Exendin-4干预后,GLP-1R在大鼠心肌组织中的分布特点和表达变化。2.观察烫伤大鼠早期心肌细胞凋亡指数和心肌组织Caspase-3活性的变化规律。3.观察Exendin-4干预后大鼠的心肌细胞凋亡指数及心肌组织Caspase-3活性的改变,试图阐明Exendin-4对烫伤大鼠早期心肌细胞凋亡的影响及其机制。材料和方法1.实验动物与分组：健康成年SD大鼠(南方医科大学实验动物中心提供)54只,体质量(200+20)g,雌雄不拘。随机分为：正常对照组(N组,n=6)单纯烫伤组(S组,n=24)和烫伤后Exendin-4干预组(E组,n=24),S和E组又再分为6、12、24和48h四个时间点,每个时间点6只动物。2.动物模型的制作：动物称重后以3%戊巴比妥钠40 mg/kg行腹腔内注射麻醉。背部剪毛后再以10%硫化钠脱毛,按公式S=K·W2/3(K=9.0, S单位：cm2,W单位：g)计算出大鼠总体表面积,烧伤面积=总体表面积x30%。将背部脱毛区浸入100℃水中15 s造成30%TBSAⅢ°烫伤(病理结果证实),伤后按Parkland公式,即每kg体质量每1%烧伤面积4 m1林格平衡盐液行腹腔注射补液,将总量的一半分为2等份,于伤后即刻和伤后4h注入,另一半则分为4等份,于伤后8、12、16和24 h注入。伤后第2个24小时,液体量减半,分3次均匀补液。大鼠分笼喂养,自由进食。E组给药方法：将Exendin-4溶解于0.2 mL注射用水,以Exendin-4 5 ug/kg,2/日,腹部皮下注射,第一次于伤后即刻注入。3.检测指标及方法：分别于各时间点深度麻醉后处死实验大鼠,取左心室心尖部心肌组织待测。采用免疫组织化学染色技术检测GLP-1R分布特点及表达变化；DNA原位末端缺口标记技术(TUNEL法)测定心肌细胞凋亡并计算凋亡指数；免疫荧光分析法检测心肌组织Caspase-3活性(结果以反应中Caspase-3催化形成的pNA的浓度表示)。4.统计学处理：数据用均数±标准差表示。应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理。本实验为3×4*6的析因设计,计量资料行完全随机分组两因素析因分析(即two-way analysis of variance),了解各变量之间的主效应和交互作用；各时间组、处理组之间行单项分类的方差分析(one-way analysis of variance);等级资料采用Kruskal-Wallis H检验；变量间相关性分析采用Pearson相关系数法。当P<0.05时,差异有统计学意义。结果1.正常对照组、单纯烫伤组和Exendin-4干预组大鼠的心肌组织均存在大量的GLP-1R表达,其主要分布于心肌细胞的胞膜、胞浆和胞核中。各组实验大鼠心肌组织GLP-1R的表达量均未见显著差异。2.烫伤大鼠心肌细胞凋亡指数于伤后6、12、24、48 h均有显著升高。相比N组仅见少量的凋亡细胞表达(0.23±0.32%),S组于伤后6h心肌细胞凋亡指数即显著升高(8.13±2.88%),12h达高峰(14.80±5.46%),此后逐渐下降,伤后24、48 h凋亡指数(10.27±4.48%,7.07±2.90%)仍显著高于N组。Exendin-4干预组大鼠心肌细胞凋亡指数于伤后6、12、24、48 h均有显著下降。E组在伤后四个时间点的凋亡指数分别为(4.03±1.18%,6.50±1.41%,3.70±1.05%,2.90±1.11%),与S组相应时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.烫伤大鼠心肌组织Caspase-3活性于伤后6、12、24 h均有显著升高。相比较N组(47.86±16.09mmol/L),S组心肌组织Caspase-3活性于伤后6h即显著升高(104.33±29.92mmol/L),12 h达最大值(162.87±43.53mmol/L),之后逐渐降低,伤后24h(111.65±20.43mmol/L)仍显著高于正常。E组于伤后6、12、24 h心肌组织Caspase-3活性(65.86±7.80mmol/L,83.01±16.85mmol/L,66.82±13.61 mmol/L)均显著低于S组。4.对S组、E组做Pearson相关分析,相关系数分别为0.674、0.511,P值均小于0.05,心肌细胞凋亡指数与心肌组织Caspase-3活性之间呈显著正相关。结论1.单纯烫伤和Exdendin-4干预后大鼠的心肌组织均存在大量的GLP-1R表达,其主要分布于心肌细胞的胞膜、胞浆和胞核。2.单纯烫伤和Exdendin-4干预后大鼠心肌组织GLP-1R的表达量与正常大鼠比较均未见显著变化,提示Exdendin-4的抗凋亡作用可能并非通过调节GLP-1R的数量,而是通过结合、活化GLP-1R,启动下游分子信号所致。3.烫伤大鼠早期的心肌细胞凋亡指数和心肌组织Caspase-3活性均显著升高。Exdendin-4干预可显著降低伤后早期大鼠的心肌细胞凋亡指数和心肌组织Caspase-3活性。4. Exdendin-4可能通过结合、活化GLP-1R,启动细胞内相关信号通路,降低Caspase-3活性,从而抑制心肌细胞凋亡。