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玉米大斑病是由玉米大斑病菌引起的玉米叶部主要病害,培育和种植玉米抗病品种是防治玉米大斑病最经济、有效的途径。因此,分离、克隆玉米抗大斑病相关基因,明确其编码蛋白的身份和功能,对于揭示玉米抗大斑病的分子机制和抗病基因工程育种具有重要意义。 本试验以玉米自交系B37Htl与玉米大斑病菌0号小种和1号小种构成的非亲和性组合和亲和性组合为试验材料,利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)对玉米叶片的基因表达情况进行分析,回收非亲和性互作中特异表达的基因片段,对其进行克隆、测序及同源性分析。 试验获得以下主要结果: ①采用PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,对26个随机引物进行筛选。结果发现,6个引物适合一步扩增法,退火温度在40～47℃之间;9个引物适合两步扩增法,退火温度(第二步扩增)在46～51℃之间。 ②利用筛选出的随机引物对cDNA样品进行DDRT-PCR扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,共获得差异表达基因片段107条。这些片段可以分为三类:A.亲和性互作及对照中没有,非亲和性互作中特有的片段26条,占24%;B.与亲和性互作及对照相比,非亲和性互作中表达量增加的片段39条,占36%;C.与亲和性互作及对照相比,非亲和性互作中表达量降低的片段42条,占40%。对它们进行回收和二次扩增,经1.2%琼脂糖电泳检测,其中98个回收产物能产生扩增条带,差异条带的回收率为92%。 ③经反式Northern杂交检测,最终获得阳性片段46条,阳性率为46.9%,其中A类片段10条。占21.8%:B类片段19条,占41.1%;C类片段17条,占37.1%。 ④选出A类片段中的5条进行克隆、测序和同源性分析,结果发现它们与已知蛋白质序列的同源性都比较低,为30%～40%,可能为新基因。对于这些片段的功能还需进一步获得基因全长和通过功能互补实验才能确定。