论文部分内容阅读
研究目的:探讨丙酮酸激酶M2型（PKM2）在缺血性脑损伤中的作用机制以及探索缺血损伤后神经保护治疗靶点和治疗方式。研究方法:（1）首先构建小鼠MCAO模型,检测缺血半暗带组织中PK酶活性的变化。通过WB的方法检测缺血性脑损伤后PKM2表达量及其四聚体的变化。通过构建PKM2基因敲除小鼠模型,研究PKM2对PK活性的影响。（2）通过TTC染色比较梗死面积研究PKM2活性变化对缺血损伤程度的影响。通过对磷酸戊糖途径代谢产物的分析研究PKM2活性变化对磷酸戊糖途径代谢流量的影响。通过检测NADPH/NADP+比值和GSH/GSSG比值研究PKM2活性变化对损伤脑组织抗氧化能力的影响。（3）给予MCAO模型小鼠经颅直流电刺激（tDCS）干预研究tDCS对缺血性脑损伤后PK活性和PKM2四聚体变化的影响。梗死面积比较和神经行为学评分（mNSS）探讨tDCS对缺血性脑损伤的神经保护作用。运用PKM2活性调节剂研究PKM2活性变化对tDCS保护作用的影响。实验结果:（1）缺血性脑损伤后,缺血半暗带组织中的丙酮酸激酶（PK）活性升高。丙酮酸激酶M2型（PKM2）表达增加,其高活性的四聚体形式比例升高。PKM2基因敲除小鼠MCAO模型发现,PKM2敲除可以降低缺血损伤后脑组织中的PK活性。特异性的PKM2活性调节剂可以影响缺血损伤脑组织中的PK活性。（2）提高缺血损伤后PKM2活性可以使梗死面积更大,加重损伤。抑制PKM2活性可以减少梗死面积,使损伤减轻。PKM2活性的变化可以影响磷酸戊糖途径的代谢通量,使葡萄糖的代谢过程发生重编程。激活PKM2可以抑制磷酸戊糖途径,而抑制PKM2活性可以提高磷酸戊糖途径代谢产物的水平。缺血损伤后PKM2活性的变化同样影响组织的抗氧化能力。高活性PKM2降低组织中NADPH/NADP+比值和GSH/GSSG比值,抑制损伤组织的抗氧化能力。而抑制PKM2活性可以增加NADPH/NADP+比值和GSH/GSSG比值,增强损伤组织的抗氧化能力。（3）tDCS治疗可以降低缺血损伤后高活性PKM2四聚体的比例,降低缺血半暗带组织中的PK活性。TTC染色结果表明,tDCS治疗可以减小MCAO模型小鼠的梗死体积,而给予PKM2激动剂TEPP-46可以影响tDCS的保护作用。mNSS评分表明,tDCS可以改善缺血损伤后小鼠的神经功能缺损。给予tDCS干预治疗的同时增加TEPP-46,可以影响小鼠MCAO后的神经功能恢复程度。实验结论:本研究课题发现了PKM2在缺血损伤中的作用机制,PKM2活性升高加重缺血损伤,因此PKM2可能成为缺血损伤的治疗靶点。同时发现tDCS可以抑制损伤后PKM2的活性。在动物模型中验证了tDCS可以通过抑制PKM2的活性促进神经功能恢复,为其临床应用提供了理论依据。首先,缺血损伤后,缺血半暗带组织中的丙酮酸激酶（PK）活性升高,丙酮酸激酶M2型（PKM2）表达增加,其高活性的四聚体比例升高。其次,高活性PKM2抑制磷酸戊糖途径,降低损伤脑组织的抗氧化能力。最后,tDCS通过抑制PKM2活性介导葡萄糖代谢重编程,增强磷酸戊糖途径,增加组织的抗氧化能力,在小鼠MCAO模型中减少梗死体积,改善神经功能缺血评分,发挥神经保护作用。