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蛋白质去泛素化是指由去泛素化酶(deubiquitinases,DUBs)介导的蛋白质泛素化的负向调节过程。泛素和去泛素化调节的动态平衡,影响或者调节细胞的生长、发育、信号转导、等许多细胞生理病理过程。去泛素化酶通过水解底物蛋白质上的泛素链调控蛋白的稳定性,其活性直接影响细胞内多种蛋白的周转率、活性、再生以及定位。P5091属于泛素特异性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease7,USP7)的噻吩类抑制剂,能高度特异性抑制USP7酶的活性,并且在多发性骨髓瘤的治疗中显示良好的抗肿瘤效果,对万珂、多柔比星等耐药的多发性骨髓瘤细胞也具有抑制作用。此外,P5091抑制结肠直肠癌细胞的增殖和诱导凋亡。然而,P5091在食管鳞癌中的作用及分子机制仍需进一步研究。本文主要通过体外实验来研究P5091在食管鳞癌中作用及机制,评价P5091对食管鳞癌增殖、凋亡、克隆形成等的作用,进一步利用si RNA技术沉默靶基因的表达来反向验证P5091对食管鳞癌细胞的作用,阐明P5091在食管鳞癌细胞中作用的具体分子机制,为食管鳞癌治疗的新药开发提供理论基础,为今后P5091应用于临床食管鳞癌的治疗提供理论基础。方法1.USP7在食管鳞癌中的表达水平检测:取多株食管鳞癌细胞系和食管癌组织芯片进行USP7蛋白水平的检测,选取有代表性的细胞系为本实验所用细胞系:KYSE450、KYSE510、KYSE30。2.药物浓度筛选:通过ATP依赖的荧光素酶细胞活性检测来计算在不同细胞系中P5091的IC50值,从而确定不同细胞系的实验药物浓度。3.平板克隆形成实验和细胞形态学图片分析:评价不同浓度的P5091对食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖抑制效应。4.细胞凋亡检测:用AnnexinV-FITC和PI染色检测不同浓度的P5091对食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30凋亡的影响。5.Caspasae-3的激活情况:用FITC-DEVD-FMK染色法检测Caspase-3激活情况;Western Blot检测P5091作用后食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的c-PARP和c-caspase-3的表达情况。6.P5091对抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的影响:Western Blot检测P5091作用后食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30中抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白的变化,本实验中Noxa发生明显变化。7.P5091对Noxa m RNA水平的影响:用Q-PCR的实验方法测定P5091处理食管鳞癌细胞后不同时间点促凋亡蛋白Noxa的m RNA水平变化。8.Noxa在P5091诱导细胞凋亡中的作用:对Noxa基因沉默后通过流式细胞术来检测不同浓度P5091引起的食管鳞癌细胞凋亡率的变化。9.转录因子4(Activating transcription factor 4,ATF4)上调Noxa:同时对Noxa和调节Noxa基因表达的上游调控分子ATF4进行基因沉默,通过流式细胞术检测不同浓度P5091引起的细胞凋亡率的变化。用Western blot的方法检测对Noxa、ATF4基因沉默后凋亡标志性蛋白c-PARP蛋白水平的变化。结果1.P5091抑制食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30的增殖ATPlite实验、平板克隆以及形态学观察的实验结果显示,P5091可以明显抑制食管鳞癌细胞增殖,并且呈浓度依赖性。2.P5091诱导食管鳞癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30发生凋亡流式细胞术检测结果表明不同浓度P5091引起食管鳞癌细胞发生明显的凋亡,总凋亡率随药物浓度增加而升高。同时Western blot实验结果表明:细胞凋亡标志性蛋白c-PARP和c-caspas3的表达增加,并且随着药物浓度增加而增高。3.P5091通过促进促凋亡蛋白Noxa的表达来诱导食管鳞癌细胞的凋亡Western Blot结果显示,P5091处理后Noxa蛋白水平明显增高。Q-PCR结果显示:P5091处理后在不同的时间点食管鳞癌细胞中Noxa的m RNA水平均有明显升高。对食管鳞癌细胞进行Noxa基因沉默后,不同浓度P5091引起食管鳞癌细胞的总凋亡率与Noxa基因敲除前相比明显降低,且c-PARP蛋白水平也明显降低,提示Noxa可能是P5091作用的关键分子。4.P5091诱导食管鳞癌细胞发生内质网应激(ERS)Western blot结果显示P5091处理后ERS的标志性蛋白p-EIF2α、ATF4、CHOP蛋白水平明显增高,提示P5091诱导食管鳞癌细胞发生ERS。5.P5091通过上调ATF4,进而引起Noxa积聚,最终诱导细胞凋亡Western blot结果显示P5091处理后ATF4和Noxa蛋白水平明显升高,且流式结果提示P5091诱导细胞凋亡。同时,Q-PCR结果提示P5091也上调了Noxa的m RNA水平。为了进一步探究Noxa是否是受ATF4调控,我们进行Noxa和ATF4的基因沉默实验。结果提示:RNA干扰沉默ATF4后,P5091引起的细胞凋亡率明显降低,c-PARP和Noxa蛋白水平明显降低,提示ATF4很可能是P5091引起食管鳞癌细胞凋亡中Noxa积聚的主要调节因子。结论1.P5091显著抑制食管鳞癌细胞的增殖。2.P5091通过ERS上调ATF4的表达,促进Noxa的表达,进而引起食管鳞癌细胞凋亡。