重组人白细胞介素2(rhIL-2)是一种用于临床上治疗肺部癌症的蛋白类药物,目前一系列临床研究表明,rhIL-2对各种癌症细胞均具有一定的治疗效果。通常情况下蛋白类药物制备为注射剂剂型具有稳定性差、半衰期短、靶向性评价困难等缺点,目前常用的方法是将蛋白类药物制备成具有缓释效果的微球。传统的缓释微球制备工艺包括喷雾干燥法,超临界干燥法等,由于其反应条件剧烈以及表面活性剂的添加等因素导致蛋白类药物缓释微球具有突释现象明显、活性保持率低等问题,而静电喷雾的工艺通过一步法制备缓释长效剂型,不仅能降低其毒性作用,提高给药的间隔时间,而且避免了传统的蛋白类药物制备工艺造成的蛋白活性降低等问题。因此本文采用同轴静电喷雾法实现一步法制备核壳结构rhIL-2微球,具体而言,本课题利用同轴静电喷雾,制备内核以壳聚糖为载体包裹荧光量子点与蛋白药物偶联的共价结合物,以透明质酸钠作为微球外壳的载体材料,制备核壳结构复合载药微球,该同轴核壳结构微球具有主动靶向到肺部肿瘤部位从而达到局部治疗的作用,并可以通过活体成像对其靶向性进行评价,进一步通过体内实验对微球在体内释药过程进行研究。本文共分为五个部分,具体如下:一、综述本部分首先介绍了同轴静电喷雾技术在制备蛋白给药系统微球方面的应用并进行了简要概述;然后对量子点的光学性能特点以及在靶向示踪方面的作用,以及量子点与蛋白偶联的方法进行了讨论;介绍了透明质酸钠作为癌细胞表面CD44特异性受体在主动靶向方面的作用与研究;最后总结了重组人白细胞介素2在抗肿瘤方面的作用和目前的研究进展。二、量子点与rhIL-2蛋白偶联物的制备与表征本部分对课题组合成的水溶性量子点(QDs)进行了粒径和形态的表征;接下来是对量子点与重组人白细胞介素2的偶联工艺进行优化,具体包括了对量子点与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)以及蛋白(rhIL-2)的摩尔比进行优化,并通过间接法检测量子点与蛋白的偶联效率进行了验证,其最优处方工艺为:QDs与EDC的比例为1:1000,EDC与NHS的比例为1:1,QDs与rhIL-2的比例为1:2,反应的环境为pH为7.4的硼酸盐缓冲液,反应时间为2 h,制备rhIL-2-QDs蛋白复合物;其次是通过动态光散射(DLS)对偶联前后粒径和电位进行表征,结合琼脂糖凝胶电泳对量子点与重组人白细胞介素2的偶联产物的生成进行了表征;最后对偶联物的蛋白生物活性和量子点的光学性能通过圆二色谱和荧光显微镜进行了验证。三、核层静电喷雾微球的制备与表征本部分先用白蛋白(BSA)作为模型药物优化单轴静电喷雾制备核层微球的工艺参数,根据制备微球的粒径与形态对一系列参数进行了优化,具体参数包括载体浓度,正级电压大小,针孔孔径和喷雾流速等因素。确定的处方工艺为:喷雾电压为25 kV,接受距离为21 cm,壳聚糖浓度为1%,助纺剂PVA的浓度为1%,最佳喷射速度为0.02 mm/min,针孔孔径为0.67 mm。制备的核层微球形态良好,粒径大小分布均一在0.5μm-2.0μm左右,同时通过间接法测得微球的包封率为83.47±2.69%左右,载药量为20.23±3.18μg/mg左右,说明药物被很好的包裹在以壳聚糖为载体的微球中。荧光显微镜下可见微球荧光性能良好,有利于后期微球的靶向示踪研究。四、同轴静电喷雾微球的制备与表征本部分先用白蛋白(BSA)作为模型药物优化同轴静电喷雾制备核-壳结构微球的工艺参数处方工艺,对同轴静电喷雾工艺进行了探索和研究,具体包括对载体浓度,正电压大小,针孔孔径和喷雾流速等因素的考察,考察最优处方工艺为:喷雾电压为25 kV,接受距离为21 cm,核层溶液流速为0.02mm/min,壳层溶液流速为0.04 mm/min,并通过扫描电镜表征了其核壳微球的成功制备,通过DLS测量同轴微球粒径在1.2μm-2.0μm左右,适用于肺部主动靶向的要求。进一步使用rhIL-2重现最优处方工艺,并通过圆二色光谱对微球中rhIL-2的蛋白生物活性进行表征;并通过MTT法,对同轴微球的安全性进行评价,结果表明当同轴载药微球浓度达到7.5 mg/ml时细胞存活率达到90%,由此证明该工艺制备微球的安全性良好,符合实验要求;同时通过生物活性实验,对微球的肺癌细胞抑制率进行评价,结果表明相同药物浓度的微球蛋白的生物活性能达到重组白细胞介素2的90%左右。本部分通过动物体内试验对同轴微球的实时示踪性能,主动靶向性能进行考察。根据活体成像结果,观察到同轴微球荧光量子点主要集中于肺部癌症部位,而同轴核层空白载药微球对照组在肺部基本上没有荧光量子点分布,说明同轴微球确实具有主动靶向示踪的效应。