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目的:制备兔抗人神经特异性转录因子LMO3的多克隆抗体、鼠抗人钙整合素结合蛋白CIB的多克隆抗体;观察多巴胺对星形胶质细胞增殖及钙信号的影响.
方法:(1)将构建好的原核表达载体pET32a-LMO3、pET32a-CIB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导BL21(DE3)分别表达LMO3、CIB融合蛋白,以SDS-PAGE鉴定融合蛋白LMO3、CIB的表达。用含LMO3、CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原分别免疫兔及BALB/c/小鼠制备抗血清,抗血清经protein-G亲和层析后用酶联免疫吸附试验、Western blot及免疫组化检测该抗体的特异性;(2)原代培养星形胶质细胞,纯化后以免疫组织化学方法鉴定,流式细胞仪检测多巴胺对胶质细胞细胞周期的影响,激光共聚焦显微镜检测多巴胺对胶质细胞胞内游离钙离子浓度的影响。
结果:(1)通过重组表达获得LMO3、CIB抗原蛋白,分别免疫兔及小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗LMO3、CIB多克隆抗体,制备的抗体不但能检测外源性表达的重组蛋白并且能检测细胞内源性表达的蛋白;同时免疫组化的结果显示,LMO3在SHG44胶质瘤细胞株,星形胶质细胞瘤、乳腺癌、结肠癌组织中定位于细胞质,在少突胶质细胞瘤组织中主要定位于细胞核中;CIB在SHG44胶质瘤细胞株、Huh7肝癌细胞株,星形胶质细胞瘤、乳腺癌、结肠癌组织中主要定位于细胞质,在少突胶质细胞瘤组织中定位于细胞核中。(2)原代培养星形胶质细胞,纯化后GFAP鉴定星形胶质细胞比例为95%以上,经多巴胺孵育后细胞在S期DNA含量增高,细胞内游离钙离子浓度升高。
结论:(1)制备了特异性的兔抗人LMO3、鼠抗人CIB抗体,对进一步研究LMO3、CIB的功能奠定了基础。(2)成功分离培养了星形胶质细胞,初步了解了多巴胺对胶质细胞细胞周期及钙离子变化的影响。