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近年来由于雌激素等内分泌干扰物对人类健康和生态安全造成了严重的威胁,逐渐引起国内外学者的广泛关注,并对其在自然环境中的污染水平、富集程度、迁移方式和转化过程等进行深入研究。生物修复法即利用微生物降解环境雌激是解决雌激素污染的有效方法之一。阐明雌激素降解微生物的基因组结构与特性是利用微生物代谢能力进行环境雌激素降解的基础和前提。本文以17β-雌二醇(E2)为目标污染物,筛选获得1株具有E2高效降解能力的红球菌,并对其基因组结构特征、降解酶基因分布和表达特征进行研究,同时与其他红球菌基因组进行比较分析,为今后雌激素降解工程菌的构建奠定了基础。1.雌激素降解菌的筛选与鉴定以雌二醇为唯一碳源筛选出一株雌二醇高效降解菌株,使用酶标仪和高效液相色谱法测定菌株生长曲线和雌二醇的剩余量,通过观察发现菌株能够很好的生长和利用雌二醇,在第三天雌二醇降解率达到最高97%,在第五天时OD600值达到了0.155。对菌株进行形态学观察、生理生化分析和16S rDNA的序列分析与鉴定,结果表明,该菌株为放线菌门,放线菌纲,红球菌属马红球菌。命名为Rhodococcus.DSSKP-R-001(简称RD1)。保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)。2.红球菌DSSKP-R-001的全基因组测序及功能基因注释利用第二代、第三代测序技术对Rhodococcus.DSSKP-R-001进行全基因组测序和功能基因的注释。基因组草图序列包括基因组大小约为5.4 Mbp、G+C含量为68.72%,以及含有5180个预测蛋白质编码基因。菌株Rhodococcus.DSSKP-R-001基因组由三个复制子构成,一个染色体和两个质粒。染色体大小为5.2 Mbp,两个质粒分别为0.09 Mbp和0.09Mbp。使用COG、GO、KEGG和Swiss-Prot数据库分别注释到3736个基因、3472个基因、2590个基因和1932个基因。通过功能基因注释,结果显示共得到10种与雌激素降解酶主要相关的基因,且各种酶基因在整个序列中具有广泛分布和不等的重复出现的特征。3.雌激素降解酶的验证与表达通过聚合酶链式反应(PCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对雌二醇降解酶的存在及表达进行了验证,共发现十种直接参与类固醇降解的酶,即3α-羟基类固醇脱氢酶、3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶、乙醛脱氢酶、胆固醇氧化酶、3-酮类固醇-9α羟化酶、双加氧酶、3,4-DHSA双加氧酶、单加氧酶、乙酰辅酶A乙酰转移酶、3-酮酰基辅酶A硫解酶,同时,其中有四种酶3-酮类固醇-9α羟化酶、单加氧酶、双加氧酶、乙醛脱氢酶进行了mRNA的表达。4.基因组比较分析运用比较基因组学方法将Rhodococcus.DSSKP-R-001与Rhodococcus.sp.P14、Rhodococcus jostii.RHA1、Rhodococcus opacus B4进行二维共线性、平行共线性以及Venn图比较分析,发现Rhodococcus.DSSKP-R-001与Rhodococcus.sp.P14相似性最高,与Rhodococcus.sp.P14、Rhodococcus jostii.RHA1、Rhodococcus opacus B4和Rhodococcus equi 103S共有的基因有2070个,其中1159个基因参与物质代谢,菌株之间表现出进化的同源性。