论文部分内容阅读
因外伤、肿瘤切除、感染和先天性疾病导致的骨缺损在临床治疗中仍面临巨大挑战。尽管骨组织具有一定的自我修复能力,但骨缺损范围超过临界值时,骨组织的自我修复不足以完成骨修复,需要干预措施以促进骨再生。目前,临床上治疗大段骨缺损的策略包括自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨移植。自体骨移植是治疗骨缺损的金标准,但它存在来源有限、对供体有损伤等缺点。异体骨移植同样存在潜在疾病传播及免疫排斥等不足。而人工骨支架具有材料来源广泛、成分可控及安全性高的优势,能够有效解决上述问题。构建仿生骨组织细胞外基质结构及功能的人工骨修复支架以加速骨修复是骨组织工程领域研究的重点。骨组织可以看作是一种天然纳米复合材料,主要由有机蛋白质（主要是I型胶原蛋白）、无机矿物质（主要是磷酸钙）和多种细胞类型构成。当骨缺损发生时,间充质干细胞在骨缺损修复过程中发挥了重要作用,它能向缺损处迁徙,并分化为成骨细胞。成骨细胞通过分泌未矿化的胶原蛋白以及碱性磷酸酶,促进矿物质沿胶原纤维沉积,从而实现骨再生。目前,利用生物材料直接负载干细胞或通过负载生长因子促进干细胞迁徙的方法具有促进骨再生的作用,但这种方法在临床转化应用中往往受到复杂监管要求的限制。因此,改善骨修复材料的理化性质以调动人体自身干细胞促进骨修复是目前研究的热点。本研究制备了负载黑磷纳米片（Black phosphorus nanosheets,BPNS）和纳米氧化镁的多功能复合水凝胶,在不添加额外生物成分的基础上,实现促进干细胞迁徙、成骨分化及生物矿化,从而达到加速骨组织原位再生的目的,并对相关作用机制进行分析。主要研究内容如下:首先,采用液相剥离法制备了BPNS,并利用扫描电镜、原子力学显微镜、粒径分析仪对BPNS的形貌及尺寸进行表征,证明了所制备的BPNS片层大小均匀,具有典型的二维结构。之后利用聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol,PVA）/壳聚糖（Chitosan,CS）负载纳米氧化镁（Magnesium oxide,Mg O）和BPNS,通过反复冻融的物理交联法制备了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶。通过傅里叶变换红外光谱仪、扫描电镜及热重分析仪及万能力学试验机等分析了复合水凝胶的形貌、结构及力学强度。结果表明,PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶具有较好的多孔结构,能够持续缓释Mg2+和磷酸盐。同时,Mg O降解形成弱碱性微环境,能够和磷酸盐协同促进其体外生物矿化性能。其次,通过体外近红外光（Near Infrared,NIR）照射分析了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶的光热转换性能,选取金黄色葡萄球菌及大肠杆菌对其体外抗菌性能进行检测。结果表明,PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶在NIR照射下具有良好的光热转换性和稳定性。同时,在NIR照射下,基于CS固有抗菌性能和光热治疗的双重作用,PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶对上述两种细菌的抗菌率均超过99.9%,能够有效预防植入物相关感染的发生。再次,通过多向诱导分化、流式细胞检测等对分离的大鼠骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。通过细胞活死染色、细胞增殖检测等方法,证明了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶具有良好的细胞相容性。通过Transwell细胞迁移实验、体外成骨实验等证明了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶能够促进间充质干细胞迁徙和成骨分化。通过RNA测序及对相关作用机制进行了初步探索,证明了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶通过激活Pi3k-Akt信号通路实现促进细胞迁徙和成骨分化。最后,建立了大鼠临界颅骨缺损模型,将PVA/CS-Mg O-BPNS植入缺损部位后,通过Micro-CT、HE染色、Masson染色、免疫组化染色等手段证明了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶能够有效促进新生骨形成。同时,体内安全性实验证明了PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶对主要脏器不会产生毒性作用,具有良好的体内生物相容性。综上所述,PVA/CS-Mg O-BPNS复合水凝胶具有良好的生物相容性及骨诱导性,是良好的骨组织工程支架材料,在促进骨修复中具有极大的应用前景。