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胃癌是最常见的消化系肿瘤,在我国其发病率位于恶性肿瘤的第2位,死亡率位于第3位,其中胃腺癌又占胃恶性肿瘤的90%以上。研究已证实白细胞介素-1β(IL-1β)与胃腺癌的发生与发展相关,但迄今为止其分子机制尚未完全清楚。原癌基因Src的表达产物c-Src蛋白激酶是最早发现的Src家族激酶(SFKs)成员,先前的研究发现IL-1β可激活肺腺癌细胞中的c-Src,从而增加细胞的迁移;IL-1β和c-Src均能增加胃腺癌细胞的存活,然而L-1β是否也能激活胃腺癌细胞中的c-Src,从而引起胃腺癌细胞生物学行为的改变及其机制到目前为止尚未见相关的报道,因此,本课题选择对其进行初步的探究。在本研究中,我们选择胃腺癌MKN-45细胞作为研究对象,目的是为了初步阐明IL-1β在MKN-45细胞中是否能激活c-Src,探究IL-1β激活c-Src后对胃腺癌细胞存活的影响,并初步探究其机制是否涉及到STAT3,旨在为寻找胃腺癌患者治疗的新方法奠定良好的实验基础。研究分为三个部分进行。第一部分研究的内容是“IL-1β通过c-Src蛋白激酶增加胃腺癌细胞存活作用的初步研究”,技术路线方法包括:1.Annexin V+PI染色,流式细胞仪测定细胞凋亡检测IL-1β刺激对MKN-45细胞存活的影响,并利用IL-1β中和抗体预处理细胞,检测其预处理后对IL-1β增加MKN-45细胞的存活是否存在抑制作用。2.Western-blot法测定MKN-45细胞接受IL-1β刺激后,磷酸化c-Src蛋白的表达以及IL-1β中和抗体和c-Src特异性抑制剂PP1对IL-1β诱导的c-Src激活的抑制作用。3.应用c-Src特异性抑制剂PP1结合Annexin V+PI染色后流式细胞仪测定细胞凋亡,检测PP1预处理后对IL-1β增加MKN-45细胞的存活是否存在抑制作用。第二部分研究的内容是“c-Src低表达细胞株的获得以及抑制c-Src的表达对IL-1β促进胃腺癌细胞存活作用的影响”,技术路线方法包括:1.建立针对c-Src基因两个不同靶位的c-Src sh RNA稳定转染的c-Src低表达的MKN-45细胞株。2.Annexin V+PI染色后流式细胞仪测定细胞凋亡实验检测c-Src表达沉默后对IL-1β增加MKN-45细胞存活是否存在抑制作用。第三部分研究的内容是“初步探究IL-1β激活c-Src蛋白激酶增加胃腺癌细胞存活的机制”,技术路线方法包括:1.应用免疫共沉淀试验初步探讨IL-1β激活c-Src是否通过诱导TRAF6与c-Src相互作用从而激活c-Src;2.western-blot检测分别应用c-Src及Stat3特异性抑制剂PP1及WP1066预处理前后,以及转染c-Src sh RNA抑制c-Src的表达后,对IL-1β增加MKN-45细胞中磷酸化Stat3表达的影响。3.应用Stat3抑制剂WP1066进一步检测IL-1β增加胃腺癌细胞存活的机制是否涉及Stat3。第一部分结果:1.IL-1β刺激后可减少血清饥饿诱导的MKN-45细胞的凋亡细胞凋亡测定结果显示:无血清培养的MKN-45细胞接受IL-1β刺激后,其凋亡数显著降低,与未接受IL-1β刺激的对照细胞比较,差异具有统计学意义p<0.05;用IL-1β中和抗体预处理细胞后,此作用则被抑制,表明IL-1β能够增加胃腺癌MKN-45细胞的存活。2.IL-1β的刺激可激活胃腺癌细胞MKN-45的c-Src蛋白激酶Western blot结果显示:IL-1β刺激后,能激活胃腺癌MKN-45细胞的c-Src,可检测到磷酸化的c-Src表达上调,此作用可被IL-1β中和抗体和c-Src特异性的抑制剂PP1所抑制,表明IL-1β能够激活c-Src。3.IL-1β促进胃腺癌细胞MKN-45的存活作用可被c-Src特异性抑制剂PP1所抑制,表明IL-1β增加胃腺癌细胞存活的作用可能是通过激活c-Src蛋白激酶。第二部分结果:1.成功地获得了c-Src低表达的MKN-45细胞稳定转染p GPU6/GFP/Neo-c-SRC sh RNA1和p GPU6/GFP/Neo-c-SRC sh RNA2以及si RNA阴性对照(p GPU6/GFP/Neo-Scramble sh RNA)稳定转染细胞株。2.敲减c-Src的表达后,明显减弱IL-1β促进MKN-45细胞存活的能力,进一步表明IL-1β增加胃腺癌细胞存活的作用是通过激活c-Src蛋白激酶。第三部分结果:1.免疫共沉淀结果初步表明:IL-1β激活c-Src是通过诱导TRAF6与c-Src形成复合物而实现的。2.IL-1β激活c-Src蛋白激酶后通过激活其下游信号分子Stat3增加胃腺癌细胞存活。Western blot测定结果表明,接受IL-1β刺激后,MKN-45细胞中的磷酸化的Stat3表达增加,此作用可分别被c-Src和Stat3的特异性抑制剂PP1和WP1066以及转染c-Src sh RNA抑制了c-Src的表达所抑制。3.Annexin V+PI染色后流式细胞仪测定细胞凋亡结果显示:用Stat3抑制剂WP1066预处理的MKN-45细胞接受IL-1β刺激后,细胞凋亡显著增加。结论:通过本研究我们得到初步的结论是:IL-1β可激活c-Src蛋白激酶,后者再激活Stat3,从而增加胃腺癌MKN-45细胞的存活。