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人感染高致病性禽流感H5N1自1997年首次在香港报道后，病毒感染人的情况不断发生。截至2010年3月29日，WHO确证了15个国家的人感染高致病性禽流感病毒H5N1病例共490例，其中死亡290例。我国确诊感染38例，死亡25例，病毒的致死性一直大于50％。另外，病毒在野生鸟类和家禽中的持续传播和造成的灾难性后果，不仅给人们带来重大经济损失，同时也在加速病毒的进化和变异，大大增加了病毒对人们健康的威胁。虽然目前仅在少数几个国家发现病毒在家族内部有限的人传人传播，但是从应对下一次未知时间的流感大流行的战略性行动角度考虑，高致病性禽流感病毒H5N1仍需加强防范。疫苗接种是流感病毒流行时期减少发病和死亡的重要措施之一。而目前基于鸡胚生产的高致病性禽流感病毒H5N1的疫苗生产周期长、产量受到生产原料鸡胚的限制，疫苗的免疫原性低于普通的季节性流感疫苗，急需改进。如何提高疫苗的免疫原性，增强疫苗的保护效果一直是疫苗研制的关键问题。提高疫苗主要成分血凝素（Haemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的表达也是一个可行的办法。本研究选择A/Anhui/1/2005(H5N1)的HA和NA基因构建高致病性禽流感病毒H5N1的载体疫苗，通过基因的密码子优化提高抗原的表达，通过比较基因优化前后的免疫原性，以及比较不同载体和不同基因的单独及联合免疫的免疫原性，期望能够得到一个合适的免疫方案。这不仅为研制适用于我国的高致病性禽流感病毒H5N1的预防性疫苗打下基础，同时也为防治下一次可能的流感大流行提供一个思路。
具体而言，本研究将从我国人感染高致病性禽流感病毒病例中分离到的、WHO推荐的Clade2.3.4疫苗候选株A/Anhui/1/2005(H5N1)的HA和NA基因作为研究对象，将其分别构建到几种不同的载体上，包括质粒DNA疫苗载体(pVR-1012)、5型重组腺病毒疫苗载体(rAdV5)以及1型和2型嵌和的重组腺相关病毒载体( rAAV2/1)。共构建6种疫苗，分别是含有野生型和参照人密码子优化的HA基因的重组腺病毒载体疫苗(rAdV-Wt.HA和rAdV-Mod.HA)、含有裂解位点改造的参照人密码子优化的HA基因的重组腺相关病毒载体疫苗（rAAV-ΔMod.HA）、含有野生型和参照人密码子优化的NA基因的重组腺病毒载体疫苗（rAdV-Wt.NA和rAdV-Mod.NA）以及含有优化的NA基因的质粒DNA疫苗(pVR-Mod.NA)。并对得到的疫苗进行鉴定，包括PCR方法鉴定目的基因的插入.Western blot或免疫荧光方法鉴定目的蛋白的表达以及针对不同疫苗采用不同的方法来鉴定疫苗的含量等。最后通过免疫BALB/c小鼠来考察和比较疫苗的免疫原性，本研究先比较含有单个基因的疫苗的免疫效果，在此基础上考察含有HA和NA基因的疫苗的联合免疫的效果，对不同疫苗及不同免疫策略在BALB/c小鼠体内诱导的体液和细胞免疫效果进行评价和比较。实验中分别使用血凝抑制试验或神经氨酸酶活性抑制试验方法检测含有HA或NA基因疫苗的体液免疫反应，以及使用ELISPOT方法检测疫苗的细胞免疫反应。
结果：表明：
1)对于含有HA基因的疫苗：①单次免疫比较，rAAV-ΔMod.HA激发小鼠产生的抗体水平最高并且持续较长时间；②两次免疫比较，rAdV-Mod.HA单独免疫两次诱导小鼠产生的免疫反应最好；③从A/Anhui/1/2005(H5N1)HA全序列中筛选到了两个能够刺激BALB/c小鼠CD8+T淋巴细胞分泌IFN-y的表位，即HA212-229:TYISVGTSTLNQRLVPKI和HA534-543:IYSTVASSLA，后者比前者强。④对于不同载体的联合免疫比较，rAdV-Mod.HA单独免疫两次和rAdV-Mod.HA与重组痘苗病毒载体疫苗RVJ11LacZ75-Mod.HA/Mod.M2（谭文杰课题组构建）联合免疫的效果相当。
2)对于含有NA基因的疫苗：①密码子优化后的NA基因表达水平显著提高；②rAdV-Mod.NA激发小鼠产生的体液和细胞免疫水平均高于rAdV-Wt.NA；③从A/Anhui/1/2005(H5N1)NA全序列中筛选到了两个能够刺激BALB/c小鼠CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位，即Pep16(NA109-124):CRTFFLTQGALLNDKH和Pep26(NA182-199)：AVAVLKYNGIITDTIKSW，并且后者的刺激能力比前者强。
3)对于HA和NA基因联合免疫的比较发现：①两者联合后免疫两次和同等剂量单独免疫两次的免疫效果相当，只有NA特异性细胞免疫反应有所不同（联合免疫低于单独免疫两次）；②单次联合免疫的效果低于联合免疫两次的效果，但仍明显优于含有铝佐剂的A/Anhui/1/2005(H5N1)灭活疫苗免疫两次的效果。
综上所述，从BALB/c小鼠的免疫结果来看，单次免疫比较发现，以我国主要流行的Clade2.3.4中的A/Anhui/1/2005(H5N1)疫苗候选株HA基因为基础构建的重组腺相关病毒疫苗rAAV-ΔMod.HA单次免疫诱导的体液免疫效果最好，并且HA抗原的表达时间最长。以优化的HA和NA基因为基础构建的重组腺病毒疫苗可同时诱导产生较高的体液和细胞免疫反应，其中两者联合免疫两次诱导的免疫反应最好：同时，两者联合免疫一次的免疫效果也已大大高于含有铝佐剂的A/Anhui/1/2005(H5N1)灭活疫苗免疫两次的效果，推测单次联合免疫的策略也有一定的应用前景。