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目的：通过观察Btk抑制剂联合NFκB抑制剂及酪氨酸激酶Bcr-abl抑制剂,对B细胞肿瘤包括淋巴瘤细胞(Raji、Ramos)及急性淋巴细胞白血病细胞(Sup-B15、 RS4;11)的生物学的影响,研究Btk对上述细胞增殖、凋亡的影响,并揭示其可能作用机制,以探讨PCI-32765用于Ph+和Ph-ALL靶向治疗的可行性及临床意义。方法：1、利用PCI-32765和Bortezomib处理Raji、Ramos细胞：1.1分别利用CCK-8法及流式细胞术检测其对细胞增殖、凋亡的影响；1.2 Western blot检测PCI-32765和Bortezomib单药及联合用药对凋亡相关蛋白表达水平的影响。2、利用PCI-32765和Bortezomib处理RS4;11、Sup-B15细胞：2.1分别检测其对细胞增殖、凋亡的影响；2.2 RT-PCR检测PCI-32765和Bortezomib单药及联合用药后Btk、NFκB在RNA水平表达情况；2.3Western blot检测PCI-32765和Bortezomib单药及联合用药对NFκB活性及相关凋亡蛋白表达的影响。3、利用PCI-32765和Dasatinib处理RS4;11、Sup-B15细胞：3.1检测PCI-32765、Dasatinib单药及联合用药对细胞生长、增殖的影响；3.2刘氏染色观察PCI-32765、Dasatinib单药及联合用药对细胞形态的影响；3.3 Western blot检测PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药对Btk上下游信号分子表达及活性的影响。结果：1、PCI-32765和Bortezomib对Rajk Ramos细胞作用及其机制：1.1不同浓度Bortezomib(10nmol/L、20 nmol/L、30 nmol/L、40 nmol/L、50 nmol/L、60 nmol/L、 80nmol/L)和PCI-32765(0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L、4.0μmol/L、 5.0μmol/L、6.0μmol/L)处理Raji和Ramos细胞,均可抑制细胞存活率,抑制作用呈时间和剂量依赖性,且两药具有协同作用。1.2 Bortezomib和PCI-32765单药及联合用药处理Raji和Ramos细胞48小时后。1.2.1单药组与对照组,联合用药组与单药用药组及对照组比较,细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。1.2.2单药组细胞Btk、NFκB、c-IAP1、BCL-XL的表达水平较空白对照组降低,Caspase-3的表达水平升高,两药联用后,作用增强。2、PCI-32765和Bortezomib对RS4;11、Sup-B15细胞作用及其机制：2.1不同浓度Bortezomib (2.5nmol/L、5.0 nmol/L、7.5 nmol/L、10.0 nmol/L、12.5 nmol/L 15.0nmol/L、17.5 nmol/L、20.0 nmol/L)和PCI-32765 (0.5μmol/L、1.0μmol/L、 2.0μmol/L、4.0μmol/L、6.0μmol/L、8.0μmol/L、10.0μmol/L)作用细胞48小时,均可抑制细胞活性,呈剂量依赖性,且两药具有协同作用。2.2Bortezomib(10nmol/L)和PCI-32765(3μmol/L、8μmol/L)单药及联合用药处理RS4；11和Sup-B15细胞48小时后。2.2.1对于RS4；11细胞,空白对照组、Bortezomib和PCI-32765单药组、两药联用组细胞凋亡率分别为(5.21±2.18)%、(40.97±4.09)%、(37.21±6.98)%、(78.30±3.39)%,单药组与对照组,两药联用组与单药组及对照组比较,细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)2.2.2对于Sup-B15细胞,空白对照组、Bortezomib和PCI-32765单药组、两药联用组细胞凋亡率分别为(9.37±1.08)%、(41.03±5.29)%、(32.14±6.18)%、(73.09±4.32)%,单药组与对照组,两药联用组与单药组及对照组比较,细胞的凋亡率明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。2.3Bortezomib和PCI-32765单药及联合用药对RS4;11、Sup-B15细胞Btk、NFκB mRNA表达的影响。2.3.1对于RS4；11细胞,加药组Btk、NFκB mRNA表达水平较空白对照组下降,差异有统计学意义,且两药联用组表达水平下调幅度明显大于单药组。2.3.2对于Sup-B15细胞,加药组Btk、NFκB mRNA表达水平较空白对照组降低,差异有统计学意义,且两药联用组表达水平下调幅度明显大于单药组。2.4BortezomibκPCI-32765作用细胞后,单药组细胞核中NFκB表达水平比空白对照组降低。且两药联用后,细胞核中NFκB表达水平比空白对照组及单药组进一步下降,差异有统计学意义(p<0.05)。2.5 Bortezomib(10nmol/L)和PCI-32765(3μmol/L、8μmol/L)单药处理组较空白对照组Btk、NFκB、抗凋亡蛋白BCL-XL的表达水平降低,凋亡蛋白Caspase-3的表达水平增高。两药联用后,作用增强,差异有统计学意义(p<0.05)3、PCI-32765和Dasatinib对RS4;11、Sup-B15细胞作用及其机制：3.1细胞生物学特性的影响：3.1.1 PCI-32765 (0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)、 6μmol/L、8μmol/L、10μmol/L)作用RS4；11和Sup-B15细胞,均可抑制细胞的增殖,且呈剂量依赖性,但对两株细胞抑制程度不一,Sup-B15细胞对其敏感性高于RS4；11,两者IC50比值约为3：8,分别约为3μmol/L和8μmol/L,差异有统计学意义(p<0.05)。3.1.2 Dasatinib (1.0μmol/L、2.0μmol/L、3.0μmol/L、 4.0μmol/L、5.0μmol/L、6.0μmol/L、7.0μmol/L、8.0μmol/L、9.0μmol/L 10.0μmol/L)作用于RS4；11和Dasatinib (1.0nmol/L、2.0nmol/L、3.0nmol/L、 4. Onmol/L、5.0nmol/L、6.0nmol/L、7.0nmol/L、8.0nmol/L、9.0nmol/L、10.0nmol/L)作用于Sup-B 15细胞,均可抑制细胞增殖,且呈剂量依赖性,与RS4；11相比,Dasatinib对Sup-B15细胞增殖的抑制更强,二者IC50比值约为1：1000,分别约为5nmol/L和5μmol/L,差异显著(p<0.05),与PCI-32765联用后,增殖抑制作用增强,差异具有统计学意义(p<0.05)。3.1.3 PCI-32765和Dasatinib分别作用RS4；11和Sup-B15细胞8h、12h、24h、36h、48h及72h以后,PCI-32765、Dasatinib单药组及联合用药组的细胞存活率均逐渐降低,且两药具有协同作用,呈时间依赖性。3.1.4刘氏染色观察PCI-32765、Dasatinib单药组及联合用药对RS4；11、Sup-B15细胞形态影响,药物处理组细胞体积缩小,细胞质密度增加,核固缩、核偏位、核碎裂,但小剂量Dasatinib单药对RS4；11细胞凋亡促进不明显,联合用药组凋亡细胞增多。3.2 PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药对Btk上下游信号分子表达及活性的影响：对于Sup-B15细胞,Bcr-abl、Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度正相关；对于RS4；11细胞,Btk、Lyn、Src表达水平及活性亦均降低,与药物浓度正相关。结论：1、PCI-32765、Bortezomib对Raji、Ramos细胞具有增殖抑制、促进凋亡等作用,且药物作用具有协同性。其作用机制可能是通过抑制NFκB、c-IAP1、 BCL-XL表达、增强Caspase-3表达。2、PCI-32765和Bortezomib可协同抑制ALL细胞RS4;11、Sup-B15的增殖及促进其凋亡,其机制可能是通过抑制Btk、NFκB活性,从而抑制NFκB核易位,阻止细胞NFκB持续激活,下调BCL-XL等抗凋亡蛋白、上调Caspase-3等凋亡蛋白。3、Dasatinib在人体有效浓度范围内,抑制Ph+ALL细胞Sup-B15的增殖,并且同PCI-32765具有协同作用；对于Ph-RS4;11细胞,单药Dasatinib在人体可耐受范围内无明显效果,但联用PCI-32765后,则可促进RS4；11细胞凋亡,抑制其增殖,其机制可能是通过靶向抑制B细胞受体信号通路中的关键激酶Btk、Bcr-abl和Src家族激酶等,从而抑制恶性B细胞增殖,促进其凋亡。联合用药不仅给Ph+ALL患者提供新的治疗思路,对Ph-ALL患者的治疗可能具有重要的临床意义。