研究背景及目的手部肌腱损伤和手外伤在日常生活中尤为常见,不仅影响患者生理和心理健康,同时也极其严重地影响了患者的工作能力,造成了个人和社会巨大的经济损失。指屈肌腱损伤后的临床标准流程是立刻进行修复手术,并早期恢复患指活动以防止术后黏连。但由于常合并多发伤,无法早期进行康复训练,导致与周围组织粘连严重,严重影响手部功能;或肌腱损伤较为严重,缺损部分较大,无法进行一期修复手术等,均是肌腱移植术的适应症。然而,自体移植物由于来源有限并且会造成移植物供区缺损,术后引起疼痛等并发症,临床应用受到极大的限制。而异种移植物又存在突出的伦理问题,病人接受程度较低,使得同种异体移植物有可能作为替代策略。但其术后可能会引起的免疫排斥反应不可忽视。因此,构建一种适合于指深屈肌腱损伤后的移植物迫在眉睫。随着组织工程学的不断发展,虽然目前许多人造肌腱材料逐渐衍生出来,比如聚乳酸、蚕丝和胶原蛋白等,但由于细胞外基质(ECM)的复杂组成及其特殊的生物力学特性,仍没有开发出可以取代天然肌腱的合成材料。指深屈肌腱属于滑膜内肌腱,与滑膜外肌腱相比,其表面光滑,覆盖一层薄粘多糖物质,主要成分为透明质酸(HA)和润滑素,可有效润滑。因此,如何模拟指深屈肌腱生理微环境,构建一种适应移植后长期修复,且结构功能更为优化的组织工程支架,进一步减少磨损,提高修复功能并减少排异,尚有待解决。另外,作为指深屈肌腱重要组分的肌腱细胞,对其功能和结构的完整性有着不可替代的作用,但也是解决移植物排异问题的关键所在。我们的前期研究证实,成功脱细胞后的移植物虽然排异发生率明显减少,但其内部结构和后期修复功能都受到影响,特别是受力特性发生改变。因此,如何对脱细胞化的组织工程学支架进行再细胞,如何选择合适的种子细胞以取代肌腱细胞的功能,如何进一步实现其结构重塑,是目前仍需要突破的重要难关。本课题目的是构建一种适合体内指深屈肌腱损伤修复的异体滑膜内肌腱组织工程学支架,利用脱细胞化技术减少其排异可能,并通过种子细胞的选取、种植、诱导等对其进行进行活化,验证异体脱细胞化滑膜内肌腱支架微环境对种子细胞的作用。同时,构建一种来源于自体关节液的滑膜化表面修饰物质,观察其改善脱细胞化滑膜内肌腱支架的表面滑动阻力作用。并通过模拟体内力学环境,进一步探讨移植后支架结构重塑的作用及机制。研究方法1.脱细胞化异体滑膜内肌腱组织工程学支架的构建(1)动物实验:12月龄实验犬经麻醉、消毒、手术获取双侧前爪指深屈肌腱,利用滑动阻力测量仪对指深屈肌腱Zone II区域与A2滑车韧带之间的界面的滑动摩擦力进行直接测量,并采用HE染色观察其组织结构,评价此异体滑膜内肌腱用作组织工程学支架构建的结构功能特性。进一步使用物理性深低温脱细胞法,构建脱细胞化滑膜内肌腱支架。(2)种子细胞获取:使用密度梯度离心法分离获取自体骨髓间充质干细胞,鉴定表面标志物,并在诱导条件下鉴定其多向分化能力;通过尿素提取法,获取脱细胞化肌腱支架的细胞外基质微环境,观察对种子细胞的增殖和成腱分化的作用。2.脱细胞化异体滑膜内肌腱支架结构重塑及功能优化的作用和机制研究(1)脱细胞化异体滑膜内肌腱支架的表面修饰:实验犬双侧膝关节抽取关节液,并进行碳化二亚胺衍生物交联反应,制备含有生物表面修饰活性的自体关节液,对脱细胞化异体滑膜内肌腱支架进行表面修饰。(2)支架结构重塑的作用及机制:采用机械打孔技术种植种子细胞,并给予生物反应器循环机械牵拉三维培养,通过HE染色观察再细胞化支架的结构重塑;利用PCR技术检测种子细胞间缝隙连接GJA1、肌腱组分胶原蛋白COLI及胶原重塑相关基因MMP-9的表达变化;并给予GJA1特异性阻断剂进一步验证其对支架结构重塑的作用机制。3.组织工程学滑膜内肌腱支架在指深屈肌腱重建中的应用(1)指深屈肌腱二次断裂模型建立:实验犬术肢第二指远端指间关节处切断指深屈肌腱,并在远端断端处切除3mm肌腱以增加肌腱修复的张力,行改良Kessler技术进行肌腱缝合,定期监测修复断端间距。(2)异体滑膜内肌腱支架对肌腱损伤修复的作用:分别移植自体滑膜外肌腱及异体支架,并比较给予种子细胞再细胞化处理及表面修复的异体支架,与自体滑膜外肌腱对指深屈肌腱损伤修复的作用,采用力学测试评判移植修复效果,采用组织切片染色比较生物相容性。研究结果1.脱细胞化异体滑膜内肌腱组织工程学支架的构建(1)选取指深屈肌腱作为滑膜内肌腱支架的主体结构来源,所得肌腱样品的组织学特点、表面滑动阻力特性和结构组分均符合滑膜内肌腱支架的要求。(2)所得滑膜内肌腱支架脱细胞化效果良好,但表面滑动性能有所损害。所得骨髓间充质干细胞可稳定增殖,具有良好的分化全能性。脱细胞化肌腱支架的基质微环境有利于种子细胞的增殖和成腱分化。2.脱细胞化异体滑膜内肌腱支架结构重塑及功能优化的作用和机制研究(1)经过碳化二亚胺衍生物交联反应的自体关节液,对脱细胞化异体滑膜内肌腱支架进行表面修饰后,滑动阻力显著降低。(2)通过生物反应器仿生三维培养的肌腱支架复合物,在循环轴向力学牵拉的刺激下,支架内部纤维结构排列更为紧致,排列方向与牵拉应力的方向高度一致。同时,种子细胞可以更好地在支架内部进行迁徙,以及成腱相关基因更高效地表达,并且证实力学牵拉刺激改变支架内种子细胞间的连接间隙相关基因GJA1,进一步调控胶原重塑相关基因MMP-9的表达,促进细胞外基质内胶原蛋白组分的合成与降解,促进支架组织结构重塑。3.组织工程学滑膜内肌腱支架在指深屈肌腱重建中的应用生物复合物滑膜化修饰且复合种子细胞再植的脱细胞化滑膜内肌腱支架用于指深屈肌腱重建术后效果与自体滑膜外肌腱移植物相比,其与周围组织的粘连较少,表面滑动阻力较低,重建后的关节活动度较好,与宿主天然肌腱的生物相容性好,但是在与宿主的骨端连接仍有待改善。结论本研究通过异体指深屈肌腱,成功构建了同种异体滑膜内肌腱支架。采用物理性深低温技术进行脱细胞化处理,通过自体骨髓间充质干细胞获得种了细胞,经机械打孔对其进行再细胞化,并进一步采用表面修饰及循环机械牵拉成功完成结构重塑及功能优化。并通过生物反应器三维培养及GJAl特异性阻断剂,阐明了种子细胞间缝隙连接对MMP-9的反馈调控机制。进一步在动物体内验证了生物复合物滑膜化修饰且复合种子细胞再植的脱细胞化滑膜内肌腱支架应用于肌腱重建术的疗效。为临床肌腱损伤提供了新的治疗策略。