研究背景和研究目的缺血再灌注过程中，谷氨酸过度释放造成的神经兴奋毒作用是缺血性脑损伤的重要机制。谷氨酸受体GluK2亚基被过度激活后，通过脚手架蛋白PSD-95与酪氨酸蛋白激酶MLK3结合，形成GluK2-PSD-95-MLK3信号模块。在此模块中，MLK3通过交叉磷酸化而将自身激活，并作用于其下游底物，通过MAPK信号级联，最后激活转录因子c-Jun，引起FasL表达增加。这就是所说的MAPK信号通路介导凋亡的核通路。Fas是重要的死亡受体，FasL表达的增加提示FasL-Fas信号通路在GluK2-PSD-95信号模块介导的缺血性脑损伤中发挥终极作用。然而Fas信号通路是否真的在GluK2-PSD-95信号模块介导的缺血性脑损伤中发挥重要作用，以及Fas介导缺血性脑损伤的具体机制目前并不很清楚。Fas凋亡信号通路广泛存在于各种组织细胞。Fas被配体FasL激活后，其胞内区与FADD结合，并通过FADD募集凋亡蛋白caspase8，组装成DISC复合体。在此复合体中，caspase8自身裂解活化，继而启动caspase信号级联或刺激线粒体释放Cyt c而激活凋亡执行蛋白caspase3，引起DNA水解和细胞凋亡。Fas凋亡信号通路中的信号分子受到多种机制的调节。Fas的巯基亚硝基化修饰能够促进其由胞浆向胞膜转位，并在胞膜上聚集成高分子量的聚合体CD95hi，同时向胞浆内化。CD95hi能够与FADD和caspase8组装成hiDISC，hiDISC是Fas介导凋亡的更主要形式。本研究分两个部分，分别利用PSD95的PDZ1抑制性环肽和Fas shRNA，采用生物化学和组织染色的方法，证明GluK2-PSD-95信号模块通过Fas信号通路介导缺血性神经元损伤；利用生物化学的方法，研究NO供体GSNO保护缺血再灌神经元的机制，从而反映Fas信号通路介导缺血性脑损伤的机制。第一部分GluK2-PSD-95信号模块通过Fas信号通路介导缺血性神经元损伤方法1.用TUNEL法，检测PDZ1环肽阻断GluK2-PSD-95结合后，再灌注5d大鼠海马CA1区锥体神经元凋亡情况的变化。2.用免疫荧光方法，检测PDZ1环肽对缺血再灌过程中Fas和FasL表达的影响；用免疫印迹和免疫沉淀的方法，检测PDZ1对缺血再灌过程中DISC组装和下游信号蛋白活化的影响。3.用DAPI染色法检测Fas shRNA对OGD后原代大鼠海马神经元凋亡的影响。结果1.TUNEL检测显示，缺血前给予PDZ1环肽显著减少了大鼠海马CA1区神经元的凋亡。2.缺血前给予PDZ1环肽显著抑制了再灌6h FasL表达的增加、DISC的组装和下游凋亡蛋白的激活，但是对Fas表达没有明显影响。3.OGD前给予Fas shRNA显著减少了复糖复氧过程中原代海马神经元的凋亡。第二部分GSNO通过抑制Fas巯基亚硝基化和Fas信号转导在缺血性脑损伤中发挥神经元保护作用方法1.用焦油紫染色方法，检测大鼠全脑缺血前给予GSNO对海马CA1区神经元死亡的影响。2.用免疫印迹的方法，检测GSNO对缺血再灌注过程中凋亡相关蛋白活化的影响。3.用生物素转化法，检测缺血再灌注过程中Fas巯基亚硝基化的变化，及缺血前给予GSNO对Fas巯基亚硝基化的影响。4.用生物素转化法，检测缺血前给予GSNO对nNOS巯基亚硝基化的影响；NOS活性检测试剂盒和NO检测试剂盒检测GSNO对nNOS活性和NO生成的影响。5.缺血前给予nNOS抑制剂7-NI，生物素转化法检测Fas巯基亚硝基化的变化。6.用免疫印迹方法，分别检测缺血再灌过程中Fas和CD95hi在胞膜和胞浆中的表达变化，及GSNO对其影响。7.用免疫沉淀方法，检测GSNO对缺血再灌过程中DISC和hiDISC组装的影响。结果1.大鼠全脑缺血前给予GSNO显著减少了再灌注5d海马CA1区神经元的死亡。2.缺血前给予GSNO显著抑制了再灌注6h凋亡相关蛋白的活化。3.大鼠全脑缺血再灌注过程中Fas巯基亚硝基化增强，再灌注6h达高峰；缺血前给予GSNO显著抑制了再灌注6h Fas的巯基亚硝基化。GSNO对照组中Fas巯基亚硝基化也有较明显增强，但是远远低于缺血再灌注组。4.缺血再灌6h nNOS巯基亚硝基化降低，其活性及NO生成量显著增加；缺血前给予GSNO则显著增强nNOS的巯基亚硝基化，但是抑制了其活性和NO生成。5.缺血前给予7-NI，再灌6h Fas巯基亚硝基化显著降低。6.缺血再灌过程中，Fas的胞膜表达量明显增加，再灌6h达高峰；Fas的胞浆表达量相应地显著减少，以再灌6h为低谷；CD95hi的胞膜表达量也有显著增加，且再灌6h为高峰；而且CD95hi的胞浆表达量呈同样的增加趋势。缺血前给予GSNO阻止了再灌6hFas和CD95hi在胞膜和胞浆中表达的变化。7.缺血前给予GSNO显著抑制了再灌6h DISC和hiDISC组装的增强。结论鉴于以上实验结果，我们得出以下结论：1.缺血再灌过程中，GluK2-PSD-95信号模块通过Fas信号通路介导神经元损伤。2. NO供体GSNO通过使nNOS巯基亚硝基化而抑制其活性，减少NO生成，从而使Fas的巯基亚硝基化降低，抑制其膜转位、聚集和内化，以及DISC组装和下游凋亡蛋白的活化，最终实现其保护缺血再灌神经元的功能。