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[目的]
1.诱导HL-60细胞表达肿瘤坏死因子，RT-PCR扩增TNF-α全长片段。
2.构建带肠激酶酶切位点的TM-TNF-α跨膜区连接TNF-α表达质粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和带有FactorXa酶切位点的TM-TNF-α跨膜区连接TNF-α表达质粒pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α。
3.将已构建的pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表达质粒瞬时转染3T3细胞。
4.验证融合蛋白表达情况。
5.验证酶消化细胞的细胞液中是否存在TNF-α。
[方法]
1.用佛波酯和脂多糖诱导HL-60细胞表达mTNF-α，反转录扩增TM-TNF-αcDNA。
2.分别构建TM-TNF-α全长序列的克隆质粒pcDNA3.1-TM-TNF-α、带肠激酶酶切位点的TM-TNF-α跨膜区克隆质粒pcDNA3.1-TM-enterokinase、带有FactorXa酶切位点的TM-TNF-α跨膜区克隆质粒pcDNA3.1-TM-FactorXa。通过重叠PCR将已替换了enterokinase酶切位点和FactorXa酶切位点的跨膜段与s-TNF-α DNA片段连接后，插入pcDNA3.1(+)质粒以构建pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表达载体。
3.将已构建的pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表达质粒瞬时转染3T3细胞。
4.通过RT-PCR鉴定mTNF-αmRNA的表达。
5.Western blotting检测细胞总蛋白中TNF-α和胞外消化液中TNF-α表达。
[结果]
1.成功构建了TM-TNF-α全长序列的克隆质粒pcDNA3.1-TM-TNF-α。
2.成功构建了带肠激酶酶切位点的TM-TNF-α跨膜区克隆质pcDNA3.1-TM-enterokinase、带有FactorXa酶切位点的TM-TNF-α跨膜区克隆质粒pcDNA3.1-TM-FactorXa、带肠激酶酶切位点的TM-TNF-α跨膜区连接TNF-α克隆质粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和带有FactorXa酶切位点的TM-TNF-α跨膜区连接TNF-α克隆质粒pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α。
3.检测了重组质粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α在3T3细胞中表达情况，两种质粒均能表达融合蛋白。
4.pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α质粒表达了跨膜的融合蛋白。
[结论]
成功构建了两种表达质粒，在3T3细胞中均可检测到融合蛋白的mRNA，Western blotting也能检测出融合蛋白；其中pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α质粒转染的细胞产生的融合蛋白是以跨膜形式存在，在相应的酶消化后，其胞外段的活性区脱落，形成了s-TNF-α。