粘细菌按照其利用底物类型的差异,分为嗜细菌群和嗜纤维素群两大类,在嗜纤维素群中,纤维堆囊菌属是目前唯一可以分解纤维素的菌属。目前,纤维堆囊菌通过优化发酵技术的途径提高埃博霉素产量的研究已达到瓶颈,因此,利用合成分子机制提高次级代谢产物产量是目前纤维堆囊菌研究的重点,而建立高效的遗传操作体系是纤维堆囊菌研究的基础。此外,在粘细菌类群中,同一种属的不同菌株之间,其遗传操作同样也难以通用。本文应用的纤维堆囊菌Soce157-2,在菌体中尚未发现内源性质粒,因此,应用于纤维堆囊菌遗传操作的载体,需借助外源质粒来实现,其操作难度大且效率较低,而且纤维堆囊菌对大部分的抗生素都有抗性,所以,遗传标记的筛选范围较窄,限制了其分子水平研究的进展。上述基本状况是纤维堆囊菌遗传操作困难原因的一方面,另一方面是由于限制修饰系统的存在,明显阻碍或减少了外源DNA的进入。外源DNA由于没有被修饰过,一旦进入细菌内就会被降解,很大程度上影响了该菌遗传操作的成功率。基于上述分析,本文将在以下方面进行研究:1.对实验室所用菌株纤维堆囊菌So ce157-2进行了系统的生理生化反应和32种抗生素抗性的分析,为纤维堆囊菌的遗传操作和限制修饰系统的探究提供了可靠的生理生化基础,通过实验结果的分析和对前人实验的综合考虑,选用了氯霉素作为筛选标记。由于纤维堆囊菌不同于其他细菌,代时长,生长缓慢,极易染菌,因此,本文通过一系列单因素和正交实验对纤维堆囊菌So ce157-2生长条件进行了优化,得到最佳实验条件为:装液量60 mL/250mL,在温度32℃、初始pH9.0、接种量6%、生长时间72 h、种龄60 h条件下,纤维堆囊菌So ce157-2培养活性最佳。2.纤维堆囊菌的G+C含量高,载体自身的启动子元件由于G+C含量低于So ce157-2的G+C含量,无法正常表达氯霉素抗性,因此选用aphII作为启动子。经PCR扩增获得aphII启动子片段和氯霉素乙酰转移酶基因片段,将其连接后导入自杀质粒pCVD442中,构建pCVD442-cat载体,将从So ce157-2的基因组中PCR得到的三段不同大小的片段分别导入pCVD442-cat载体中,获得pCVD442-cat-1、pCVD442-cat-2、pCVD442-cat-3三种质粒,通过接合转移的方法从双质粒大肠杆菌中转移至So157-2中,阳性率达到了100%,建立了遗传操作系统。通过pH值及热击对接合转移效率影响的摸索,确定pH值为8.5至9.0时,接合转移效率最高,较之前提高了15~18倍,但热击对接合转移效率没有影响。3.由于纤维堆囊菌遗传操作的困难及不稳定性,菌株可能存在着某些限制外源基因进入或进入菌体后影响正常表达的限制修饰屏障。通过对纤维堆囊菌Soce157-2培养液、细胞壁和细胞内核酸酶活性分析,发现该菌胞内和胞外及菌体细胞壁上均存在核酸酶,能够降解外源基因,但尚未发现内源性质粒。并克隆了Soce157-2修饰性甲基化酶、甲基转移酶等限制修饰系统的部分基因。