论文部分内容阅读
背景Holt-Oram综合征,又称心手综合征,患者有先天性心脏病伴上肢畸形的临床表现。该疾病属于常染色体显性遗传病,具有完全外显性,临床表现包括先天性房间隔和室间隔缺失、心脏传导功能障碍、上肢骨骼异常、拇指畸形。患者的子代中有50%的可能性发生新生儿出生缺陷,严重者会导致胎儿死亡或夭折,给患者家庭造成极大负担。研究发现,TBX5基因突变是Holt-Oram综合征的主要遗传学因素,约70%的患者存在该基因异常。该基因位于12号染色体,转录后形成的TBX5蛋白是胚胎发育过程中调控心脏和上肢发育的重要转录因子。目前在TBX5基因编码区、剪接区和调控区均发现了导致Holt-Oram综合征的基因突变。另外,约30%该疾病患者病因尚不明确,可能存在其他影响心脏和上肢胚胎发育的调控元件。TBX5基因突变的异质性和其与Holt-Oram综合征的相关性提示,该基因在胚胎发育中具有重要调控作用和研究价值。目的鉴定Holt-Oram综合征家系的致病基因和遗传方式,为患者提供遗传咨询;鉴定TBX5基因新突变,丰富Holt-Oram综合征基因突变异质性研究,拓宽基因突变谱;针对TBX5基因新突变的功能研究,揭示突变对基因表达、蛋白定位和转录调控功能的影响。方法采集病史、绘制家系图分析疾病临床表现和遗传方式;全外显子组测序鉴定致病基因突变;对TBX5基因突变进行氨基酸序列保守性分析和突变致病性预测;构建TBX5质粒并完成定点突变;通过实时荧光定量PCR检测基因突变对TBX5基因和靶基因NPPA mRNA表达水平的影响;通过蛋白质免疫印记实验研究基因突变对TBX5蛋白长度和表达量的影响;通过免疫荧光检测突变对TBX5蛋白细胞定位的影响;通过双荧光素酶报告系统验证TBX5基因突变的功能影响,研究突变对TBX5转录因子与NKX2-5、TAZ的协同转录作用的影响。结果1.Holt-Oram综合征的三代家系中均存在房间隔缺失、室间隔缺失、拇指畸形的临床表现,是常染色体显性遗传。严重者因先天性心脏异常而夭折。2.鉴定了TBX5基因新突变,是9号外显子的杂合移码突变c.992de1G(p.C331F fs*63)。数据库和生物信息分析显示突变具有致病性;TBX5蛋白突变区域的氨基酸序列在不同物种间具有保守性。3.针对TBX5基因突变的细胞功能学研究显示,突变型TBX5基因的mRNA水平显著低于野生型TBX5基因;TBX5基因突变产生了截短蛋白,且突变蛋白表达水平显著降低;TBX5突变蛋白的细胞定位异常。4.过表达突变型TBX5基因使其靶基因NPPA mRNA水平降低。在萤火虫荧光素酶报告系统中,证实了TBX5基因突变导致NPPA启动子的报告活性显著降低;突变使TAZ和NKX2-5对TBX5转录因子的转录促进作用受损。结论本课题在Holt-Oram综合征家系中鉴定了 TBX5基因新突变,丰富了基因突变谱,揭示了 TBX5基因新突变导致基因表达剂量不足和蛋白定位异常,降低转录因子的转录调控活性和协同作用,影响下游基因表达的作用机制。