论文部分内容阅读
作为干酪和干酪素生产过程中产生的重要副产物，乳清蛋白因其含有9种必需氨基酸而被称为是一种完全蛋白质。乳清蛋白具有优异的营养特性，如改善低血压、增强机体免疫力、维护肠道健康、降低胆固醇、促进胰岛素分泌、增强机体对矿物质吸收、抗氧化、抗癌以及抗菌能力等。此外，乳清蛋白也具有蛋白质的功能特性，例如乳化性、增稠性、胶凝性、发泡性以及成膜性等。由于其优异的营养品质和功能特性，乳清蛋白已被广泛应用于食品工业之中。为进一步扩展其在食品领域中的应用，多种物理或化学方法被应用在乳清蛋白改性上面，例如热诱导、酶交联以及化学修饰法等。同时，高压等离子体、高压脉冲电场、伽马射线辐照、高强度超声等新技术的引入对于乳清蛋白的改性研究具有深远的影响。本研究拟通过热诱导或超声诱导方法对乳清蛋白进行改性，在增强乳清蛋白的功能特性，从而提高其潜在应用价值。
此前的研究结果表明，基于乳清蛋白制备得到的纳米颗粒可以有效运载生物活性物质，显著提高其生物利用率，且明显增强其储藏稳定性。本研究首先通过超声诱导改性技术制备并表征超声改性乳清蛋白纳米颗粒，同时以DIM作为生物活性物质，通过理化指标、流变指标、微观结构、抗氧化性能以及储藏期实验验证改性后的乳清蛋白的包封性能。结果证明超声诱导可明显改善乳清蛋白的理化性质，且制备得到的DIM微胶囊具有良好的生物利用率。在后期的治疗阉割抗性前列腺癌患者的临床试验中，DIM-改性乳清蛋白微胶囊通过降低PSA水平明显改善患者生活质量。本研究制备得到的乳清蛋白基纳米颗粒对于包埋并运载生物活性物质（DIM）具有良好的作用，其物理化学性质稳定，生物利用率高，可广泛用于医疗和食品领域。本论文主要包括以下几个方面：
(1)乳清分离蛋白（WPI）-DIM纳米复合物的制备与表征(2)聚合乳清蛋白（PWP）-DIM微胶囊的理化及微观结构研究(3)超声诱导对乳清蛋白-DIM微胶囊的理化、显微结构和抗氧化性能的影响研究(4)口服乳清蛋白-DIM微胶囊对阉割抗性前列腺癌治疗的临床应用研究。
1.DIM作为一种疏水性生物活性物质，因其稳定性差、见光易分解等不良特性限制了其在食品和药品领域中的应用。通过纳米微胶囊技术可以有效保护其免受不利条件的影响。乳清分离蛋白（WPI）可作为良好的载体与疏水性纳米小分子颗粒（例如维生素、类胡萝卜素和一些风味化合物等）发生结合形成纳米复合物，从而用于纳米颗粒的运载。本研究旨在通过理化指标、热焓变、流变性状、微观结构、pH稳定性和光稳定性的等手段评估不同配方的WPI/DIM纳米复合物的特性。结果表明，当WPI与DIM的比值为2.5∶1，5∶1，7.5∶1，10∶1时，样品的平均粒径值分别为157.47±8.09、141.43±1.62、140.00±2.16、142.83±13.23nm，这一结果显著高于天然WPI的粒径(96.53±3.02nm)(P＜0.05)。因此可以通过改变制备过程中WPI与DIM的比例最终调整纳米粒子的平均粒径为96-157nm。当DIM加入体积比为2.5∶1(WPI∶DIM)时，体系分散性指数（PDI）值升高，随着DIM浓度的增加，PDI值降低，但变化不显著(P＜0.05)，且所有纳米颗粒的多分散性指数均较小于0.5。WPI-DIM纳米复合物的电位值由未形成前的-32.86±0.20mV显著下降至-42.00±2.62--48.76±4.55mV(P＜0.05)，表明DIM附着在WPI纳米颗粒上，使得最终得到的纳米复合物显示出更高的负值电位(＞-40mV)。所有样品的包封率均超过80%。流变性能指标表现为剪切变稀的非牛顿流体和假塑性(n＜1)行为，其表观粘度随剪切速率的增大而减小，随后达到稳态，即当剪切速率增加时纳米颗粒的粘度保持不变。最终结果显示增加DIM含量对WPI-DIM纳米复合物的粘度具有显著影响(P＜0.05)。
2.本研究以热聚合乳清蛋白（PWP）为壁材包埋DIM，并通过超声处理4min获得不同聚合乳清蛋白和DIM质量比的纳米复合物，并对纳米复合物的粒度，zeta电位，流变学和微观结构性质以及储存稳定性进行了测定。PWP-DIM纳米复合物平均粒径随着DIM含量的增加而显著增加（P＜0.05），粒径范围为241.33±14.82至270.57±15.28nm。所有纳米粒子的Zeta电位值均大于±30mV，表明其静电斥力强，可形成稳定的纳米复合物。所有样品的流变性状均表现出剪切变稀（n＜1），符合Sisko模型（R2＞0.997）。傅立叶变换红外（FTIR）光谱结果进一步表明当DIM结合到PWP中时，WPI二级结构含量发生显著变化，氢键吸收峰强度变强。透射电子显微镜（TEM）图像显示PWP-DIM纳米复合物的外观为球形，且表面光滑。通过分析平均粒度和色度（a*值和b*值），PWP-DIM纳米复合物在4℃、37℃和55℃条件下的储藏15天的实验结果表明，与对照组（仅限DIM）相比，实验组储藏稳定性较强。通过本研究可以发现，基于聚合乳清蛋白包埋制备的纳米复合物可显著增强DIM的储藏稳定性。
3.乳清中蛋白质主要由β-乳球蛋白和a-乳球蛋白两种球状蛋白质组成。WPC蛋白含量较WPI低，但制作工艺及制作成本显著低于WPI。同样的，WPC具有乳清蛋白所有的优良性状，且更接近于食物基质。WPC能够良好的运载生物活性物质，防止其氧化、聚集或降解。本研究通过超声诱导构建WPC-DIM纳米复合体系，在振幅为30%条件下，通过改变超声时间（0-20min）探究运载体系各项性状的变化情况。结果显示，对WPC-DIM纳米复合体系进行超声处理后，其粒径显著减小(P＜0.05)(从265nm到218nm)。超声处理5，10，15，20min后的复合物PDI显著降低(P＜0.05)，分别降至0.48，0.46，0.43，0.43。超声处理5分钟后，WPC-DIM纳米复合物的电位值从-27.96mV显著增加到-30mV。超声处理10和15分钟对纳米复合物的电位没有显著影响，而超声处理20分钟的样品其电位增长至-32mV(P＜0.05)。随着超声时间的延长(0-20分钟)，DIM包封率(EE%)从76%提高到77%、79%、81%和88%。超声处理对样品表观粘度有显著影响，随着超声处理时间的延长，表观粘度随剪切速率的变化呈下降趋势。结果表明，样品出现剪切变稀和假塑性流体现象。透射电镜(TEM)结果显示，不同超声时间处理的WPC-DIM纳米复合物均呈光滑均匀的球形，且超声处理使其粒径减小，尤其在超声处理20min时变化最显著。纳米复合物的热稳定性（变性温度和热焓变）随超声时间的增加而增加。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析表明，超声处理对WPC-DIM纳米复合物的二级结构比例有显著影响，DIM与乳清蛋白之间的静电相互作用和氢键加强。色度计结果表明不同时间的超声处理对WPC-DIM纳米复合物的a*值和b*值无显著性影响(P＜0.05)，但经过20min超声处理后b*值有明显变化。随着超声处理时间的延长，WPC-DIM纳米复合物的pH值明显升高(P＜0.05)。此外，超声处理时间对DPPH(56%~62%)和ABTS(47%~68%)自由基清除率有显著影响。综上所述，超声处理改善了WPC-DIM纳米复合物的理化性质、微观结构和抗氧化性能，因此超声处理可以应用于开发WPC基DIM纳米复合物。
4.DIM作为一种抗癌化合物，具有抗雄激素和调节雌激素代谢的作用，可降低前列腺特异性抗原(PSA)和雄激素受体水平，提高生活质量(QoL)。前列腺癌(PCa)是发达国家男性最常见的一种威胁生命的恶性肿瘤疾病。因此，本研究采用随机、安慰剂对照、单盲设计研究微胶囊化DIM对阉割抗性前列腺癌患者血清前列腺特异性抗原(PSA)水平和生活质量(QoL)的影响。两个平行实验组共20例患者，年龄为60~71岁，均被确诊为患有阉割抗性前列腺癌，病程6周。I组患者(病例组)口服乳清蛋白-DIM微胶囊，剂量为150mg，每日2次；Ⅱ组(对照组)给予150mg乳清蛋白(安慰剂)。在研究前后分别采用EORTC QLQ-PR25问卷对所有患者进行血清PSA水平及生活质量(QoL)的测定。结果显示，与对照组Ⅱ相比，Ⅰ组（病例）相关症状随口服微胶囊时间增长明显减轻(P＜0.05)。此外，实验组患者在治疗后性行为也有明显改善。实验组患者在治疗期间PSA显著下降(中位数，10%；平均值，21%；值域1%-76%)，而对照组患者PSA水平显著升高(中位数为66%；平均值，169%；值域1-415%)。复查期间，患者均未报告有明显的不良反应。根据临床实验结果，认为乳清蛋白-DIM微胶囊对阉割抗性前列腺癌具有一定的疗效，通过其抗氧化、抗炎和抗雄激素活性，有效治疗或缓解了阉割抗性前列腺癌患者病情。
通过以上研究，发现，乳清蛋白基纳米颗粒可以作为一种高效、有前途的生物活性物质（DIM）的包埋方法。该方法不仅克服了DIM的物理化学局限性，而且提高了其在医疗和营养应用方面的稳定性。此外，乳清蛋白包埋的DIM可能是通过降低转移性前列腺癌患者的PSA水平，来延缓CRPC的进展和前列腺癌的耐药性，从而改善患者生活质量(QoL)的。
此前的研究结果表明，基于乳清蛋白制备得到的纳米颗粒可以有效运载生物活性物质，显著提高其生物利用率，且明显增强其储藏稳定性。本研究首先通过超声诱导改性技术制备并表征超声改性乳清蛋白纳米颗粒，同时以DIM作为生物活性物质，通过理化指标、流变指标、微观结构、抗氧化性能以及储藏期实验验证改性后的乳清蛋白的包封性能。结果证明超声诱导可明显改善乳清蛋白的理化性质，且制备得到的DIM微胶囊具有良好的生物利用率。在后期的治疗阉割抗性前列腺癌患者的临床试验中，DIM-改性乳清蛋白微胶囊通过降低PSA水平明显改善患者生活质量。本研究制备得到的乳清蛋白基纳米颗粒对于包埋并运载生物活性物质（DIM）具有良好的作用，其物理化学性质稳定，生物利用率高，可广泛用于医疗和食品领域。本论文主要包括以下几个方面：
(1)乳清分离蛋白（WPI）-DIM纳米复合物的制备与表征(2)聚合乳清蛋白（PWP）-DIM微胶囊的理化及微观结构研究(3)超声诱导对乳清蛋白-DIM微胶囊的理化、显微结构和抗氧化性能的影响研究(4)口服乳清蛋白-DIM微胶囊对阉割抗性前列腺癌治疗的临床应用研究。
1.DIM作为一种疏水性生物活性物质，因其稳定性差、见光易分解等不良特性限制了其在食品和药品领域中的应用。通过纳米微胶囊技术可以有效保护其免受不利条件的影响。乳清分离蛋白（WPI）可作为良好的载体与疏水性纳米小分子颗粒（例如维生素、类胡萝卜素和一些风味化合物等）发生结合形成纳米复合物，从而用于纳米颗粒的运载。本研究旨在通过理化指标、热焓变、流变性状、微观结构、pH稳定性和光稳定性的等手段评估不同配方的WPI/DIM纳米复合物的特性。结果表明，当WPI与DIM的比值为2.5∶1，5∶1，7.5∶1，10∶1时，样品的平均粒径值分别为157.47±8.09、141.43±1.62、140.00±2.16、142.83±13.23nm，这一结果显著高于天然WPI的粒径(96.53±3.02nm)(P＜0.05)。因此可以通过改变制备过程中WPI与DIM的比例最终调整纳米粒子的平均粒径为96-157nm。当DIM加入体积比为2.5∶1(WPI∶DIM)时，体系分散性指数（PDI）值升高，随着DIM浓度的增加，PDI值降低，但变化不显著(P＜0.05)，且所有纳米颗粒的多分散性指数均较小于0.5。WPI-DIM纳米复合物的电位值由未形成前的-32.86±0.20mV显著下降至-42.00±2.62--48.76±4.55mV(P＜0.05)，表明DIM附着在WPI纳米颗粒上，使得最终得到的纳米复合物显示出更高的负值电位(＞-40mV)。所有样品的包封率均超过80%。流变性能指标表现为剪切变稀的非牛顿流体和假塑性(n＜1)行为，其表观粘度随剪切速率的增大而减小，随后达到稳态，即当剪切速率增加时纳米颗粒的粘度保持不变。最终结果显示增加DIM含量对WPI-DIM纳米复合物的粘度具有显著影响(P＜0.05)。
2.本研究以热聚合乳清蛋白（PWP）为壁材包埋DIM，并通过超声处理4min获得不同聚合乳清蛋白和DIM质量比的纳米复合物，并对纳米复合物的粒度，zeta电位，流变学和微观结构性质以及储存稳定性进行了测定。PWP-DIM纳米复合物平均粒径随着DIM含量的增加而显著增加（P＜0.05），粒径范围为241.33±14.82至270.57±15.28nm。所有纳米粒子的Zeta电位值均大于±30mV，表明其静电斥力强，可形成稳定的纳米复合物。所有样品的流变性状均表现出剪切变稀（n＜1），符合Sisko模型（R2＞0.997）。傅立叶变换红外（FTIR）光谱结果进一步表明当DIM结合到PWP中时，WPI二级结构含量发生显著变化，氢键吸收峰强度变强。透射电子显微镜（TEM）图像显示PWP-DIM纳米复合物的外观为球形，且表面光滑。通过分析平均粒度和色度（a*值和b*值），PWP-DIM纳米复合物在4℃、37℃和55℃条件下的储藏15天的实验结果表明，与对照组（仅限DIM）相比，实验组储藏稳定性较强。通过本研究可以发现，基于聚合乳清蛋白包埋制备的纳米复合物可显著增强DIM的储藏稳定性。
3.乳清中蛋白质主要由β-乳球蛋白和a-乳球蛋白两种球状蛋白质组成。WPC蛋白含量较WPI低，但制作工艺及制作成本显著低于WPI。同样的，WPC具有乳清蛋白所有的优良性状，且更接近于食物基质。WPC能够良好的运载生物活性物质，防止其氧化、聚集或降解。本研究通过超声诱导构建WPC-DIM纳米复合体系，在振幅为30%条件下，通过改变超声时间（0-20min）探究运载体系各项性状的变化情况。结果显示，对WPC-DIM纳米复合体系进行超声处理后，其粒径显著减小(P＜0.05)(从265nm到218nm)。超声处理5，10，15，20min后的复合物PDI显著降低(P＜0.05)，分别降至0.48，0.46，0.43，0.43。超声处理5分钟后，WPC-DIM纳米复合物的电位值从-27.96mV显著增加到-30mV。超声处理10和15分钟对纳米复合物的电位没有显著影响，而超声处理20分钟的样品其电位增长至-32mV(P＜0.05)。随着超声时间的延长(0-20分钟)，DIM包封率(EE%)从76%提高到77%、79%、81%和88%。超声处理对样品表观粘度有显著影响，随着超声处理时间的延长，表观粘度随剪切速率的变化呈下降趋势。结果表明，样品出现剪切变稀和假塑性流体现象。透射电镜(TEM)结果显示，不同超声时间处理的WPC-DIM纳米复合物均呈光滑均匀的球形，且超声处理使其粒径减小，尤其在超声处理20min时变化最显著。纳米复合物的热稳定性（变性温度和热焓变）随超声时间的增加而增加。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析表明，超声处理对WPC-DIM纳米复合物的二级结构比例有显著影响，DIM与乳清蛋白之间的静电相互作用和氢键加强。色度计结果表明不同时间的超声处理对WPC-DIM纳米复合物的a*值和b*值无显著性影响(P＜0.05)，但经过20min超声处理后b*值有明显变化。随着超声处理时间的延长，WPC-DIM纳米复合物的pH值明显升高(P＜0.05)。此外，超声处理时间对DPPH(56%~62%)和ABTS(47%~68%)自由基清除率有显著影响。综上所述，超声处理改善了WPC-DIM纳米复合物的理化性质、微观结构和抗氧化性能，因此超声处理可以应用于开发WPC基DIM纳米复合物。
4.DIM作为一种抗癌化合物，具有抗雄激素和调节雌激素代谢的作用，可降低前列腺特异性抗原(PSA)和雄激素受体水平，提高生活质量(QoL)。前列腺癌(PCa)是发达国家男性最常见的一种威胁生命的恶性肿瘤疾病。因此，本研究采用随机、安慰剂对照、单盲设计研究微胶囊化DIM对阉割抗性前列腺癌患者血清前列腺特异性抗原(PSA)水平和生活质量(QoL)的影响。两个平行实验组共20例患者，年龄为60~71岁，均被确诊为患有阉割抗性前列腺癌，病程6周。I组患者(病例组)口服乳清蛋白-DIM微胶囊，剂量为150mg，每日2次；Ⅱ组(对照组)给予150mg乳清蛋白(安慰剂)。在研究前后分别采用EORTC QLQ-PR25问卷对所有患者进行血清PSA水平及生活质量(QoL)的测定。结果显示，与对照组Ⅱ相比，Ⅰ组（病例）相关症状随口服微胶囊时间增长明显减轻(P＜0.05)。此外，实验组患者在治疗后性行为也有明显改善。实验组患者在治疗期间PSA显著下降(中位数，10%；平均值，21%；值域1%-76%)，而对照组患者PSA水平显著升高(中位数为66%；平均值，169%；值域1-415%)。复查期间，患者均未报告有明显的不良反应。根据临床实验结果，认为乳清蛋白-DIM微胶囊对阉割抗性前列腺癌具有一定的疗效，通过其抗氧化、抗炎和抗雄激素活性，有效治疗或缓解了阉割抗性前列腺癌患者病情。
通过以上研究，发现，乳清蛋白基纳米颗粒可以作为一种高效、有前途的生物活性物质（DIM）的包埋方法。该方法不仅克服了DIM的物理化学局限性，而且提高了其在医疗和营养应用方面的稳定性。此外，乳清蛋白包埋的DIM可能是通过降低转移性前列腺癌患者的PSA水平，来延缓CRPC的进展和前列腺癌的耐药性，从而改善患者生活质量(QoL)的。