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背景卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一,致死率居妇科恶性肿瘤之首,它已经成为严重威胁妇女生命安全和健康生活的主要肿瘤。目前卵巢癌临床上常规的治疗方案是以手术治疗为主,辅以铂类为基础的化疗、放疗等综合治疗。虽然我们采取如此有效、积极的治疗手段,但是其复发转移率仍很高。化疗药物耐药性的产生以及较为严重的副作用也使得患者的治疗效果堪忧,远期生存率并不理想。因此不断探寻和追求新的抗肿瘤方法是治疗卵巢恶性肿瘤的关键。目前新兴的治疗方法有细胞因子治疗、分子靶向治疗等,并且已经取得了可靠的临床疗效。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,LncRNA)是一类不编码蛋白质的RNA分子,其转录本的长度远远超过200个核苷酸单位。目前研究表明LncRNA参与了遗传印记(即基因组印记)、染色质的修饰、X染色体的沉默以及核内运输、转录干扰、转录激活等多种重要生命活动的调控过程,影响肿瘤的发生、发展,并且与肿瘤侵袭、转移及患者预后有一定关系。应激诱导长非编码转录本5(Long stress induced non-coding transcript5,LSINCT5)是长链非编码RNA家族成员之一。虽然研究表明LSINCT5在卵巢癌中的表达显著升高,能够促进恶性肿瘤细胞的增殖活化,但国内外系统研究LSINCT5与卵巢癌生物学关系的文献尚未见报道。目的本课题前期研究已经论证LSINCT5在卵巢癌组织中的表达升高,有效干扰其表达可以抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为。本研究拟在前期研究的基础上,通过检测沉默LSINCT5基因联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响,探讨小分子RNA干扰LSINCT5基因联合顺铂对治疗上皮性卵巢癌的意义以及其抗肿瘤效果的机制,为卵巢癌的基因靶向治疗联合化疗奠定实验室基础。方法1、选择上皮性卵巢癌SKOV3细胞株,按不同处理因素将卵巢癌SKOV3细胞5组:对照组、NC-siRNA组、顺铂组、LSINCT5-siRNA+顺铂组、LSINCT5-siRNA组。2、采用小分子RNA干扰技术将LSINCT5基因片段转入卵巢癌SKOV3细胞中,转染LSINCT5-siRNA联合化疗药物顺铂作用于卵巢癌细胞。3、采用CCK-8检测0、1.5、3、4.5、6、12μg/ml等6种不同顺铂药物浓度,在24h、48h、72h等不同时间段对卵巢癌细胞的毒性作用,选择适宜时间的顺铂药物浓度作为后续实验的药物处理因素。4、采用CCK-8检测转染LSINCT5-siRNA后24h,添加0、1.5、3、4.5、6、12μg/ml等6种不同顺铂药物浓度对卵巢癌细胞作用48h的抑制率。5、利用光学显微镜下观察5种不同处理组卵巢癌SKOV3细胞的生长状况及形态变化。6、利用流式细胞仪检测5种不同处理组卵巢癌SKOV3细胞的凋亡率。7、利用RT-PCR检测转染LSINCT5-siRNA后卵巢癌SKOV3细胞LSINCT5基因水平,检测5种不同处理组卵巢癌细胞中与凋亡相关的caspase3基因和caspase9基因表达水平。8、利用Western blot检测5种不同处理组卵巢癌SKOV3细胞中与凋亡相关的caspase3蛋白和caspase9蛋白表达水平。结果1、荧光显微镜下观察LSINCT5-siRNA对卵巢癌SKOV3细胞的转染效率约为80%。2、RT-PCR结果显示卵巢癌转染48h后,LSINCT5-siRNA组中LSINCT5基因mRNA的相对表达量比NC-siRNA组明显下调(P<0.05),提示小干扰RNA能有效的下调卵巢癌细胞中LSINCT5基因表达水平。3、CCK-8结果显示顺铂对卵巢癌SKOV3细胞作用48h后,3μg/ml浓度顺铂处理得到的细胞抑制率30.5%较为适中,故选择3μg/ml浓度的顺铂作用48h为后续实验的药物处理因素。4、光学显微镜下观察显示,单纯LSINCT5-siRNA组和单纯顺铂组的卵巢癌细胞数量均有不同程度的减少,细胞形态也有轻微不同程度的改变。而LSINCT5-siRNA联合顺铂组的卵巢癌细胞形态严重失常,其细胞生长稀疏,细胞形态失常呈长梭形,细胞有分叉呈“羊角”样。5、CCK-8结果显示转染LSINCT5-siRNA后能够明显提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。6、流式细胞仪检测结果显示,转染LSINCT5-siRNA联合顺铂组的细胞凋亡率明显高于单独转染LSINCT5-siRNA组和单独顺铂组(P<0.05),说明转染LSINCT5-siRNA能够协同顺铂促进卵巢癌细胞的凋亡。7、RT-PCR结果显示,LSINCT5-siRNA联合顺铂对卵巢癌细胞中与凋亡相关的基因caspase3基因表达量(2.217±0.193)和caspase9基因表达量(2.019±0.113)均明显增加(P<0.05),差异有统计学意义。8、Western blot结果显示,LSINCT5-siRNA联合顺铂对卵巢癌细胞中与凋亡相关的蛋白caspase3蛋白表达水平(1.005±0.066)和caspase9蛋白表达水平(1.245±0.050)均明显升高(P<0.05),差异有统计学意义。结论1、沉默长链非编码基因LSINCT5联合顺铂作用于卵巢癌细胞,可以抑制卵巢癌细胞的增殖,提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,促进卵巢癌细胞的凋亡。2、LSINCT5-siRNA联合顺铂可以增强卵巢癌的治疗效果。其作用机制可能与下调LSINCT5后激活caspase9和caspase3,产生细胞凋亡的级联效应有关,具体的信号通路尚需进一步研究。本实验为卵巢癌的基因靶向治疗联合化疗奠定了坚实的实验基础。