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Fibulin 家族蛋白属于分泌型糖蛋白，主要与包括基底膜和弹性微细纤维在内的细胞外基质的各种结构组件相互作用，参与细胞外基质的构成并维持其稳定。Fibulin 蛋白可以调节各种细胞过程如细胞生长、分化，血管生成及肿瘤生长，然而，它们在骨骼发育和疾病方面的作用仍不清楚。草鱼(Ctenopharyngodon idella)为我国主要淡水养殖品种，占全国鱼类养殖产量首位，至今仍在长江中下游暴发流行，波及全国，年死亡损失超过30%，严重危害草鱼养殖业的发展。研究草鱼呼肠孤病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用有助于阐明病毒蛋白的生物学功能及病毒致病机理。利用前期本实验室的酵母双杂交筛选与GCRV-JX01的VP7和GCRV-JX02W的VP56相互作用的蛋白，共同筛选出了一个细胞外基质蛋白Fibulin-4，进一步发现Fibulin-4在草鱼的肌肉、脑、肠道中表达水平较高，这与临床中草鱼出血病的红肌肉、红鳃盖和红肠症状相吻合。我们尝试运用分子生物学和细胞生物学方法进一步验证Fibulin-4与两种GCRV外衣壳蛋白之间的相互作用。本课题主要从以下三点进行研究： 1杆状病毒表达Ⅱ型呼肠孤病毒外突VP56蛋白 提取本实验室分离保存的GCRV-JX02W株的RNA，根据JX02W株S7基因序列，设计构建pFastbacHTA-S7的引物，采用RT-PCR技术扩增获得S7目的片段，将质粒pFastbacHTA-S7转入自己制备的DH10感受态，涂布卡那，庆大霉素，四环素的三抗LB平板，成功转座后，放入含50 μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素的LB液体培养基中过夜培养，使用PureLinkTMHipure试剂盒提取杆粒DNA。提取的重组杆粒DNA鉴定且测序正确后，使用转染试剂Cellfectin?II Reagent，于六孔板转染昆虫细胞SF9，待细胞出现明显病变现象时，收集细胞及分离病毒上清，运用His60 Ni Superflow Resin纯化试剂盒纯化His-VP56蛋白，用His标签抗体检测VP56的表达，结果显示自转染96h起，转染杆粒的细胞生长停滞，不断裂解。Western blot结果显示表达了重组蛋白VP56，大小约为 62KDa，为可溶蛋白，为研究其自身生物功能和进一步研究病毒与草鱼宿主细胞蛋白相互作用以及研究基于杆状病毒表达载体的 GCRV 新型基因工程疫苗奠定了基础。 2 Fibulin-4与GCRV-JX01的VP7，GCRV-JX02W的VP56的相互作用关系的鉴定 成功构建重组质粒 pEGFP-Fibulin-4 和 pDsRed1N1-VP7 与pDsRed1N1-VP56，将pDsRed1N1-VP7，pDsRed1N1-VP56分别与pEGFP-Fibulin-4共转入草鱼性腺细胞 GCO。经DAPI染色，亚细胞定位显示，病毒蛋白 VP7， VP56 和草鱼蛋白 Fibulin-4均分布于细胞质中，两种蛋白都与 Fibulin-4 有部分重叠。构建质粒pGEX-4T-3-Fibulin-4，利用尿素纯化蛋白，纯化的蛋白免疫小鼠，制备了 Fibulin-4 的多克隆抗体。纯化自己表达的 VP56 蛋白和实验室已表达的VP7蛋白。应用Dot-blot overlay技术，将原核表达纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF 膜上，经过His-VP7，His-VP56蛋白的孵育，用anti-his检测信号，结果显示随着杂交的蛋白量从低到高，蛋白信号由弱到强。His-VP7与His-VP56都能够吸附在GST-Fibulin-4蛋白上发生相互作用，而不能吸附GST蛋白。利用pull down技术，采用PierceTM pull-Down PolyHis Protein：Protein Interaction Kit试剂盒，裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白与结合His-VP7，His-VP56的HisPur Cobalt Resin，通过均能够在Elution中检测到GFP-Fibulin-4蛋白质，而检测不到对照蛋白质GFP，进一步证实了VP7， VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用。 3 病毒感染条件下Fibulin-4基因的表达研究及过表达Fibulin-4对病毒复制的影响 为了解草鱼呼肠孤病毒感染过程中宿主Fibulin-4的表达，利用荧光定量PCR与Western blot检测Fibulin-4在GCRV-JX01感染后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h五个时间点转录水平及翻译水平表达情况，结果发现病毒感染过程中，Fibulin-4的转录及翻译水平都是降低的，表明病毒感染抑制了宿主 Fibulin-4 的表达。转染pEGFP-Fibulin-4的GCO细胞经过G418筛选后，建立了GFP-Fibulin-4的稳转细胞系。过表达Fibulin-4的GCO细胞与空白GCO细胞相比，显著提高了病毒VP7的转录水平及蛋白翻译水平，并促进了病毒的滴度。