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背景:地衣芽孢杆菌活菌制剂是一种微生态活菌制剂,具有提升人体免疫力和预防疾病等作用,近年在临床治疗中逐渐广泛应用。微生态制剂产品的质量控制关键在于对该制品的安全性和有效性的评价。芽孢数作为芽孢杆菌性能的重要指标,只有芽孢数较高时才能发挥较好的益生效果。传统检测地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的方法操作繁琐,检测周期长,严重滞后于生产过程。目的:通过探索芽孢特异性物质2,6-吡啶二羧酸(DPA)的提取方法、检测方法,建立简单易行且快速检测芽孢数的高效液相色谱法(HPLC);初步探索流式细胞术(FCM)方法检测芽孢数的可行性等。方法:(1)采用传统的平板计数法,对不同温度加热处理10 min及采用80℃水浴加热处理不同时间的地衣芽孢杆菌活菌菌粉进行芽孢计数,确定提取芽孢体的最佳条件;(2)采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,0.1%磷酸(pH3.0)-甲醇(92:8)为流动相,检测波长为273 nm,流速为0.8 mL·min-1,进样量为20μL,柱温为30℃,建立HPLC法测定芽孢特异性物质DPA的含量;(3)用建立的HPLC方法检测不同处理方法得到的芽孢体中DPA含量,以确定芽孢体中提取DPA的最优方法;(4)配制不同浓度的芽孢悬液,以平板计数法进行芽孢计数,将芽孢悬液按最以上最优方法处理,采用HPLC法检测DPA含量,建立芽孢数与DPA含量的关系曲线;(5)采用平板计数法、HPLC法、FCM法对3种剂型(胶囊剂、片剂、颗粒剂)9批地衣芽孢杆菌制剂进行芽孢数检测,以判断新建立的方法的可行性。结果:(1)经80℃水浴处理30 min,提取的芽孢数最多;(2)采用HPLC法,DPA含量在2.5 mg·L-1-80 mg·L-1范围内与峰面积呈良好的线性关系;(3)芽孢悬液经121℃高温灭菌15 min处理后,加入DTT溶液0.5 mL,置65℃水浴处理30 min可以最大限度提取DPA;(4)DPA浓度在7-77 mg·L-1范围,芽孢最终浓度在6.5×108-7.8×109 CFU·mL-1范围内,呈良好的线性关系;(5)采用平板计数法、HPLC法及FCM法分别对3种剂型(胶囊剂、片剂、颗粒剂)9批地衣芽孢杆菌制剂进行芽孢数检测,结果无显著性差异(P>0.05)。结论:本课题建立的HPLC方法、FCM法可以快速检测地衣芽孢杆菌活菌制剂中芽孢数,方法准确可靠,在生产中可以同步检测芽孢数,缩短生产周期。